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东沙群岛深海微生物宏基因组文库构建与功能筛选

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本研究以中国南海东沙群岛附近海域深海沉积物为研究对象,采用玻璃珠裂解法、酶解法、化学裂解法和商品化环境基因组分离试剂盒等方法提取沉积物总DNA,用PCR-DGGE技术评价不同方法对沉积物DNA多样性的影响,在此基础上改进了DNA提取方法,提取的DNA完整性更好产率更高,并表现出较好的基因组多样性.首次构建pET30表达系统的深海沉积物宏基因组文库.文库克隆平均插入片段为1.2kb,转化效率为2.3×107个/μg DNA克隆.结合SDS-PAGE分析从pET30a表达文库筛选得到假定RNase HI基因,序列比对显示,pET30-04A11结构与功能类似于RNase HI.结果证明利用强启动子构建宏基因组文库并结合SDS-PAGE电泳分析能够有效筛选出具有蛋白表达的克隆,避免了那些有表达而无活性克隆或表达有活性却不能分泌到胞外的克隆漏筛.本文还构建了以pUC19为克隆载体的深海沉积物宏基因组文库,插入片段平均大小为6.2kb,每微克DNA得到的克隆为5000～10000个.从文库中随机挑取克隆进行序列分析.克隆pUC19-14序列分析发现该序列含有一个开放阅读框架(ORF)编码的是一种跨膜蛋白,克隆pUC19-35序列分析表明该段序列是来自与莽草酸途径基因簇相关的一段序列.其中含有两个ORF编码的蛋白是假定莽草酸激酶和3-脱氢奎尼酸合成酶,这些基因在应用生物工程生产重要药理活性物质奎尼酸和莽草酸工艺中可能具有重要价值.

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来源
《2006全国海洋生物技术与海洋药物学术会议暨全国第九届海洋药物学术研讨会》|2006年|694-700|共7页
会议地点大连
作者
赖心田; 方澍; 黄雅丽; 曹理想; 陆勇军; 林永成; 周世宁;
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作者单位

中国药学会;

中国生物化学与分子生物学会;

中国生物工程学会;

中国微生物学会;

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会议组织
正文语种
原文格式 PDF
中图分类微生物遗传学;水生微生物学;
关键词
深海沉积物; 总DNA分离; 宏基因组文库; 功能基因筛选;

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