摘要：以海参纲中的无足目锚参为原料,采用盐溶液抽提,硫酸胺分级沉淀,DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析,Sephacryl S-300分子筛层析,ZORBAX GF-250柱HPLC层析,得到海洋锚参抗肿瘤因子(Protankyra Bidentata Antitumor Factor,PBATF).采用垂直平板SDS-PAGE电泳,海洋锚参抗肿瘤因子染色显示一条带,说明达到电泳纯.PBATF用反相ZORBAX Eclipse CDB-C8柱HPLC鉴定其纯度,仅显示一明显的吸收峰,说明达到较高纯度.用紫外可见分光光度计进行全波长扫描,结果PBATF在280nm处有最大吸收峰.选择人胃癌细胞7901、人子宫颈癌细胞Hela和人非小细胞肺癌细胞NCI为研究对象,小鼠皮肤成纤维细胞929和小牛主动脉血管内皮细胞(BaEC)为对照.用MTT法测定PBATF细胞生长的效应,结果显示PBATF对三种肿瘤细胞均具有显著的生长抑制效应,并有明显的剂量依赖关系,而对正常细胞小鼠成纤维细胞和小牛主动脉血管内皮细胞只在高浓度时有抑制作用,在低浓度时无明显影响.选择人子宫颈癌细胞Hela为研究对象,小鼠皮肤成纤维细胞929为对照.观察PBATF对细胞集落形成和集落生长的效应,结果显示PBATF对Hela细胞的集落形成与生长具有明显的抑制作用,高浓度320μg/ml时无可见的集落形成,低浓度80μg/ml时集落形成数量与集落大小比生理盐水对照组0μg/ml非常显著减少.而对小鼠929细胞,高浓度320μg/ml时可见的许多集落形成,但集落很小,低浓度80μg/ml时集落形成数量与集落大小与生理盐水对照组比较无明显变化.提示海洋锚参抗肿瘤因子对肿瘤细胞的集落形成与生长均有非常显著的抑制作用,对皮肤成纤维细胞的集落形成无明显影响,但高浓度时抑制其集落的生长.观察PBATF对小鼠Lewis肺癌、小鼠H22肝癌、人体肺癌肿瘤LAX、人体肝癌肿瘤OGY及大鼠Walker-256癌肉瘤生长的抑制效应,结果显示PBATF对小鼠Lewis肺癌腋皮下接种模型的疗效,高剂量组5 mg/kg ip×8qd方案具有56.89％的抑瘤率,中剂量组1 mg/kg ip×8qd方案的抑瘤率为52.00％,低剂量组0.5 mg/kgip×8qd方案的抑瘤率为33.61％;对大鼠Walker-癌肉瘤腋皮下接种模型的疗效,高剂量组5 mg/kg ip×8qd方案具有64.15％的抑瘤率,中剂量组1 mg/kg ip×8qd方案的抑瘤率为55.82％,低剂量0.5 mg/kg ip×8qd方案的抑瘤率为44.05％;对人体肺腺癌LAX腋皮下接种模型的疗效,高剂量组5 mg/kg ip×8qd方案具有56.02％的抑瘤率,中剂量组1 mg/kg ip×8qd方案的抑瘤率为50.60％,低剂量组0.5 mg/kg ip×8qd方案的抑瘤率为40.36％;对人体肝癌QGY腋皮下接种模型的疗效,高剂量组5mg/kg ip×8qd方案具有52.07％的抑瘤率,中剂量组1 mg/kg ip×8qd方案的抑瘤率为48.31％,低剂量组0.5mg/kg ip×8qd方案的抑瘤率为33.14％;对小鼠肝癌H22腋皮下接种模型的疗效,高剂量组5mg/kg ip×10qd方案具有59.25％的抑瘤率,中剂量组1 mg/kg ip×10qd方案的抑瘤率为57.74％,低剂量组0.5 mg/kg ip×10qd方案的抑瘤率为45.28％.应用LD50方法进行急性毒性实验.结果显示PBAIF腹腔注射给药,小鼠的LD50为1.973g/kg,Sx50=0.021;其95％可信1.794～2.169g/kg.动物死亡经解剖肉眼可见,动物腹腔有积水,心肺肝肾等主要脏器充血.此外,我们将锚参以75％的乙醇水溶液浸泡提取,提取物用真空干燥器抽干后分散在纯水中,先后以乙酸乙酯和正丁醇萃取.正丁醇溶解部分首先进行硅胶色谱分离,然后进行Sephadex LH20的凝胶色谱分离,重结晶,在反相HPLC(7:3的甲醇/水体系)上进行纯化.最后获得一种新的磺化甾醇Protankyrasterol A.通过NMR、MS等多种波谱数据的解析和与已知化合物stellasterol对照,最终确定了此种新的烯醇式磺化甾醇的结构.MTT方法检测表明,不同浓度的Protankyrasterol A对癌细胞均有一定的抑制作用.浓度达9μg/ml时,对Hela细胞的抑制率为97.23％,对NCI-h6细胞的抑制率为59.98％,对929细胞的抑制率为23.16％.计算Protankyrasterol A对Hela、NCI-h6和929细胞的半数抑制率(IC50)分别为3.2±0.5 μg/ml,7.7±0.7 μg/ml和35.6±0.7 μg/ml.Protankyrasterol A作用于Hela细胞24 h后,随着样品浓度的增大,细胞凋亡率增加;在最高浓度点(18 μg/ml)时,细胞凋亡率达到62.55％.Hela细胞被不同浓度Protankyrasterol A作用16 h后,进行流式细胞仪分析.结果表明:随着药物浓度的增加,细胞生存率下降;细胞凋亡加死亡率上升;随着药物浓度的增加,明显看到细胞由早期凋亡向晚期凋亡,再到死亡的变化趋势;在第三和第四浓度点(半数抑制率附近),明显出现早期凋亡现象,且基本无细胞坏死,证明了药物的诱导凋亡作用,而无致坏死作用;随着药物浓度的增加,早期细胞凋亡率先上升后下降,呈峰形变化.
