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首页> 中文会议>2015年海南省外科年会暨广州军区普外年会 >rAAV-Slug-siRNA载体的构建及其抗胰腺癌的实验

rAAV-Slug-siRNA载体的构建及其抗胰腺癌的实验

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目的：构建并制备携带目的基因的rA AV-EGFP-Slug-siRNA(Slug「siRNA)病毒载体,探讨Slug干扰抗胰腺癌作用. 方法：首先构建pDC316-「EGF P-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316-EG FP-Slug-siRNA克隆为模板扩增EG FP-Slug-siRN A片段,EcoRI和SAlI双酶切回收PCR产物;酶切pSNAV2.0-lAczα载体质粒,并与上述产物进行连接;转化感受态大肠杆菌DH5α,得到重组质粒pSN AV2.0-EGFP-Slug-siRNA,酶切和测序对其进行鉴定.建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA,大规模制rAAV2-EGFP-Siug-siRA N并对其纯化、鉴定和滴度测定.将体外培养的胰腺癌细胞株AsPC-1转染Slug-siRNA和pSNAV2.0-EGFP空载体.Western blot及RT-PCR方法鉴定转染前后AsPC-1细胞内PUMA及Slug蛋白及mRNA表达,MTT比色法检测细胞存活率,TUNEL检查细胞凋亡. 结果：携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EG FP-SlugsiRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确.将构建成功的载体质粒与重组型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出重组腺相关病毒Slug-siRNA,经检测目的片段插入成功,滴度为9.23×1010(puf).Slug-siRNA有效抑制AsPC-1细胞内Slug表达,抑制体外细胞增殖,促进细胞凋亡,同时,伴随着Slug表达的下降,细胞内PUMA表达明显增加. 结论：成功制备出高滴度携带目的基因的Slug-siRNA病毒载体.干扰Slug表达抑制胰腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能通过解除Slug对PUMA基因的抑制有关.

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