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酶法辅助提取琼胶及琼胶寡糖制备与固定化琼胶酶工艺

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摘要

第1章 绪论

1.1 江蓠

1.1.1 江蓠的分类

1.1.2 江蓠的品种

1.1.3 江蓠的主要活性物质及其应用价值

1.2 琼胶

1.2.1 琼胶简介

1.2.2 琼胶的用途

1.2.3 琼胶的提取工艺

1.3 琼胶酶

1.3.1 琼胶酶的来源

1.3.2 琼胶酶的分类

1.3.3 琼胶酶的应用

1.4 琼胶寡糖

1.4.1 琼胶寡糖简介

1.4.2 琼胶寡糖的制备

1.4.3 琼胶寡糖的应用

1.5 固定化酶

1.5.1 固定化酶简介

1.5.2 固定化方法

1.5.3 磁性纳米载体固定化酶

1.5.4 固定化琼胶酶研究进展

1.6 本课题研究目的、意义及研究内容

1.6.1 本课题研究目的及意义

1.6.2 本课题主要研究内容

第2章 酶法辅助提取江蓠琼胶的研究

2.1 实验材料与设备

2.1.1 江蓠原料及纤维素酶

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要溶液与配制

2.1.4 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 纤维素酶活力测定

2.2.2 琼脂的理化性质检测

2.2.3 传统工艺试验

2.2.4 酶法辅助提取江蓠琼脂工艺试验

2.2.5 酶法辅助提取工艺条件的优化

2.2.6 小试工艺验证及200L中试放大试验

2.3 结果与讨论

2.3.1 纤维素酶活力的测定

2.3.2 酶解反应单因素结果分析

2.3.3 小试工艺提取琼胶的指标测定

2.3.4 200L中试放大试验

2.4 小结

第3章 琼胶酶水解工艺优化及产物分析

3.1 试验材料与仪器设备

3.1.1 菌种

3.1.2 培养基

3.1.3 药品与试剂

3.1.4 主要仪器与设备

3.2 试验方法

3.2.1 琼胶酶粗酶液制备

3.2.2 单因素试验考察琼胶酶解过程

3.2.3 琼胶酶水解琼脂的动力学分析

3.2.4 还原糖含量测定

3.2.5 平均聚合度测定

3.2.6 薄层层析(TLC)分析琼胶降解产物

3.3 结果与分析

3.3.1 单因素试验

3.3.2 动力学参数的测定及分析

3.3.3 优化工艺验证及20升罐放大试验

3.3.4 薄层层析(TLC)检测琼胶降解产物的结果分析

3.4 结论

第4章 琼胶寡糖的生物活性研究

4.1 试验材料与仪器设备

4.1.1 菌种

4.1.2 主要试剂与药品

4.1.3 主要溶液及配置

4.1.4 主要仪器设备

4.2 试验方法

4.2.1 不同聚合度琼胶寡糖的制备

4.2.2 质谱分析不同平均聚合度琼胶寡糖

4.2.3 琼胶寡糖还原能力的测定

4.2.4 琼胶寡糖对DPPH自由基清除能力的测定

4.2.5 琼胶寡糖对·OH自由基清除能力的测定

4.2.6 琼胶寡糖对ABTS自由基清除能力的测定

4.2.8 抑菌活性的测定

4.3 结果与分析

4.3.1 寡糖的ESI-MS质谱特征

4.3.2 抗氧化活性的测定

4.3.3 抑菌活性测定

4.4 小结

第5章 琼胶酶固定化工艺研究

5.1 试验材料与仪器设备

5.1.1 试验材料

5.1.2 仪器设备

5.2 试验方法

5.2.4 酶活力的测定

5.2.5 琼胶酶的固定化条件研究

5.2.6 固定化琼胶酶酶学性质研究

5.2.7 磁性纳米粒子及固定化酶表征分析

5.3 试验结果与分析

5.3.1 琼胶酶固定化条件优化

5.3.2 游离酶与固定化酶的酶学性质研究

5.3.3 磁性载体与固定化酶的表征分析

5.4 本章结论

6.1 结论

6.2 展望

致谢

参考文献

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摘要

江蓠含有丰富的胶质,是我国提取琼胶的重要原料。琼胶用途广泛,其降解产物琼胶寡糖也是一种极具开发潜力的功能性低聚糖。本论文首先利用酶法辅助工艺对江蓠琼胶进行提取。再利用筛选所得产琼胶酶菌株海洋弧菌.NT1(Vibrto sp NT1)发酵制备琼胶酶,对琼胶酶水解工艺进行优化。然后,根据酶解优化工艺制备不同平均聚合度的琼胶寡糖,并对寡糖的抗氧化及抑菌活性进行考察。最后,制各羧基功能化磁性纳米粒子(CMNPs)应用于琼胶酶的固定化。
  (1)通过单因素试验对酶法辅助提取江蓠琼胶工艺的相关因素进行探讨,以凝胶强度为主要考察指标,确定了最佳提取条件为碱处理浓度5%,碱处理时间2.5h,加酶量4U/mL,酶处理时间2.5h,酶处理温度45℃,酶处理pH7.0。在此基础上,进行200L放大试验,结果表明该工艺具有良好地稳定性与重现性。同时,该试验也证明了江蓠经纤维素酶处理后可降低碱用量而不影响所提琼胶的凝胶强度。
  (2)为探索琼胶酶水解琼胶的动态过程变化,通过试验确定了琼胶最适水解工艺条件为:水解温度40℃,pH7.0,底物浓度12g/L,加酶量为25%,振荡速率120r/mm,反应90mm,在此工艺条件下还原糖生成量达2.18g/L,平均聚合度最低值(DP)为3。通过20升罐放大试验验证了小试优化工艺条件具有良好的重现性。采用薄层色谱分析酶解产物的降解情况,结果显示在反应48h后,终产物为二糖及少量的四糖。
  (3)以不同平均聚合度琼胶寡糖为考察对象,对其抗氧化活性进行研究。平均聚合度3,4,5的琼胶寡糖及BHT对Fe3+的还原能力排序为:BHT>DP3>DP4>DP5,对DPPH的IC50为14.29mg/mL,6.65mg/mL,8.94mg/mL和0.02mg/mL,对ABTS·+的IC50为9.07mg/mL,3.04mg/mL,4.10mg/mL和0.04mg/mL。此外,平均聚合度4,5的琼胶寡糖及Vc对OH的IC50为11.58mg/mL,11.67mg/mL,3.10mg/mL,而聚合度为3的琼胶寡糖对OH无清除能力。平均聚合度3,4,5的琼胶寡糖及Vc对O2-的IC50为75.84mg/mL,24.16mg/mL,21.38mg/mL,0.07mg/mL。通过抑菌圈法测定寡糖的抑菌活性,发现三种不同平均聚合度的琼胶寡糖均无抑菌效果。
  (4)试验以CMNPs为载体建立了一种新颖、有效的方法对琼胶酶进行固定化。通过试验获得最佳固定化条件为戊二醛浓度4.0%、酶用量1mL、交联时间2h,固定化时间1h,固定化温度4℃。对载体与固定化酶进行表征分析:TEM、SEM显示载体呈规则球状,分散性良好,粒径在12nm左右;VSM结果显示载体及固定化琼胶酶具有超顺磁性。FTIR显示琼胶酶成功固定在CMNPs表面。与游离酶酶学性质对比分析,琼胶酶固定化后最适温度从50℃下降至40℃,pH从7.5下降至7.0,Km值从为11.3mg/mL下降6.9mg/mL,经7次重复使用后酶活剩余38.3%。

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