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两种植物内生和根际放线菌抑菌活性研究及Spirillospora tritici新种鉴定

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摘要

第一章 引言

1.1 放线菌的研究概况

1.2 放线菌的分类学鉴定

1.3 放线菌与植物互作

1.3.1 放线菌对植物生长的促进作用

1.3.2 植物对放线菌生长的影响

1.4 植物内生放线菌

1.4.1 植物内生放线菌概念

1.4.2 植物内生放线菌的研究意义

1.5 植物根际放线菌

1.5.1 植物根际放线菌概念

1.5.2 植物根际放线菌的研究意义

1.6 螺孢菌研究现状

1.6.1 螺孢菌的分类地位和特点

1.6.2 螺孢菌的形态特征和分布

1.7 研究目的与意义及内容

1.7.1 研究目的与意义

1.7.2 研究内容

1.8 课题来源

第二章 实验材料与方法

2.2.2 主要实验仪器

2.3 主要培养及制备方法

2.3.1 筛选分离培养基

2.3.2 纯化培养基

2.3.3 发酵培养基

2.3.4 生测培养基

2.3.5 菌丝体培养基

2.3.6 形态特征培养基

2.3.7 生理生化特征培养基

2.4 样品中放线菌分离纯化

2.4.1 样品及预处理

2.4.2 放线菌的分离培养

2.5 抑菌活性检测

2.5.1 抑制细菌活性的测定

2.5.2 抑制真菌活性的测定

2.5.3 放线菌发酵液粗提物/菌落浸提液抗真菌活性检测

2.5.4 BXT54产活性物质培养条件的筛选

2.6.1 形态培养特征鉴定

2.6.2 生理生化特征鉴定

2.6.3 化学分类鉴定

2.6.4 分子水平鉴定

2.6.5 SJ 21全基因组框架图的构建

第三章 结果与讨论

3.1 放线菌的分离结果和初步鉴定

3.1.1 放线菌分离结果

3.1.2 放线菌初步鉴定结果

3.2 生物活性的测定

3.2.1 抑制细菌的活性测定结果

3.2.2 抑制真菌的活性测定结果

3.2.3 BXT54产活性物质培养条件的筛选

3.2.4 BXT54代谢产物稳定性的研究

3.3 放线菌SJ 21的多相分类学的鉴定

3.3.1 16S rRNA的测序及系统发育分析

3.3.2 SJ 21放线菌的形态和培养特征

3.3.3 SJ 21放线菌生理生化特征鉴定的结果

3.3.4 SJ 21化学分类特征鉴定的结果

3.3.6 SJ 21(G+C)mol%测定结果

3.3.7 SJ 21基因组框架图的结构

3.3.8 SJ 21基因功能的注释

3.3.9 SJ 21次级代谢基因簇的预测

3.4 小结与讨论

3.4.1 放线菌的分离和初步鉴定

3.4.2 活性放线菌的筛选

3.4.3 BXT54产活性物质培养条件的筛选

3.4.4 BXT54代谢产物稳定性的研究

3.4.5 新种放线菌的分类鉴定

3.4.6 SJ 21基因组框架图的测定结果

4.1 主要结论

4.2 本研究的主要创新点及展望

参考文献

致谢

作者简历

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摘要

放线菌不仅是土壤生态系统中主要的组成部分,也是各种药用价值天然产物的重要来源。受植物生长和根部微生物的影响,植物根内、根际放线菌的种类比较多样、功能比较复杂。植物根内和根际放线菌不仅能在植物受到病原菌侵袭时协助植物免受病原体的侵染,也能通过产生生物活性物质来帮助植物抵抗病害。从放线菌中获得新型活性化合物或者寻找合适的微生物菌剂,来帮助植物抵抗病虫害,从而提高农产品的产量和质量,是新世纪人们所关注的一个热点问题。基于植物根内和根际放线菌的特殊性,许多研究人员开始将其作为活性放线菌的分离源。本研究首次选用传统药用植物半夏和感条锈小麦品种taichun29为实验材料,探索了这两种植物根内和根际放线菌的资源,旨在发现新型生物活性物质和新种放线菌。
  本实验选用5种分离培养基,分离纯化出了168株放线菌。在药用植物半夏的根内和根际分别分离出33株和64株放线菌;在感条锈小麦品种taichun29的根内和根际分别分离出17株和54株放线菌。利用1种病原细菌和13种病原真菌作为靶标菌来研究这些放线菌的活性,结果表明有23株放线菌具有生物活性的。其中17株至少能抑制3种病原菌的生长,10株至少能抑制5种病原菌的生长,6株至少能抑制10种以上病原菌的生长,发现有4株菌分别对苹果轮斑菌、柑橘痂圆孢菌、核盘菌和尖孢镰刀菌黄瓜专化型抑菌直径达18mm以上,有1株菌不仅对12种病原菌都有抑制作用外对其中的六种病原菌产生的抑菌直径超过20mm。此外,还有1株放线菌BXT54均能抑制这14种病原菌的生长,通过筛选确定了两种适合BXT54发酵的液体培养基(Medium2和PTM),并探究了其发酵产生活性化合物的稳定性,结果表明此活性物质具有一定的耐高温和耐酸碱的能力。这为接下来代谢产物分离纯化及化合物结构鉴定提供了理论依据。
  通过观察分离得到的菌株在培养基上生长的形态特征,并结合菌株16S rRNA在EzBioCloud网站上序列比对分析的结果,确定对菌株SJ21进行多相分类学鉴定。基于16S rRNA基因的系统发育分析和形态学特征比较,推断菌株SJ21属于螺孢菌属(Spirillospora)。与SJ21相似度最高的菌株是Spirillospora albida IFO12248T(98.75%,16S rRNA序列的相似度),其次是Actinomadura montaniterrae JCM16995T(98.68%)、Actinomadura fibrosa ATCC49459T(98.53%)和Actinomadura nitritigenes DSM44137T(98.38%)。通过在表型特征、生理生化特征、化学分类特征和分子生物学特征四方面对菌株SJ21和与其相似性较高的四个菌株进行综合分析,得出菌株SJ21是螺孢菌属的新种。将其命名为Spirillospora tritici。对Spirillospora tritici基因组框架图的测定及次级代谢产物基因簇的预测,为Spirillospora tritici在螺孢菌属中分类学地位的研究和次级代谢产物的预测提供了重要的信息基础。

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