牛结核病多重组抗原间接ELISA试剂盒的研制及应用

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为了建立一种有效的牛结核病间接ELISA方法，本研究设计了3对引物，从牛分枝杆菌ValleeⅢ菌株的基因组中PCR扩增出三个目的基因mpb70、mpb83和esat-6，采用重叠延伸剪接技术(splicebyoverlappingextension，SOE)获得融合基因mpb70-mpb83。经过多次亚克隆步骤后，将DNA片段mpb70-mpb83和esat-6串连于同一表达载体pET32a(+)中，获得了重组质粒pET70-83-E6。将该重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态后，经IPTG诱导表达带有两个六组氨酸标签的融合蛋白rM70-83-E6。以Ni2+鳌合层析的方法纯化该融合蛋白。Westernblot分析表明该蛋白具有良好的免疫反应活性。以融合蛋白rM70-83-E6作为包被抗原，在确定了最佳封闭液和最佳包被条件后，采用正交试验设计的方法摸索了最佳抗原、一抗和二抗稀释度，以及最佳一抗、二抗作用时间和显色时间，建立了检测牛结核病抗体的间接ELISA方法。用150份健康牛血清的检测结果统计分析后确定诊断方法的判定标准，即样本S/P大于0.5为阳性，小于0.4为阴性，两者之间为可疑。通过对85份牛结核病血清和100份无结核病牛血清的检测结果表明，ELISA方法的敏感性为69.41％(59/85)，特异性为96％(96/100)。对50份PPD阴性血清和67份PPD阳性血清(117份)进行检测，并与PPD皮试进行比较，本方法与PPD皮试诊断的符合率为82.05％。本研究还进行了试剂盒的初步组装，并将该试剂盒应用于现地血清样品的检测，为产业化开发奠定了基础。研究表明本试剂盒具有较好的应用价值和产业化开发前景。

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作者
郭设平;
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作者单位

中国农业科学院;

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授予单位中国农业科学院;
学科预防兽医学
授予学位硕士
导师姓名刘思国;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类牛;
关键词
牛结核病; 融合蛋白; 间接ELISA法; ELISA试剂盒;

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