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【6h】

PKCγ/P2X3介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变-痛觉敏化/去敏化的作用机制

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摘要

前言

第一部分 PTSD样应激状态下内脏敏感性／痛行为学的动态变化

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第二部分 PKCγ在中枢水平介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化／去敏化的作用及机制

实验一 在PTSD样应激状态下脊髓背角PKCγ表达动态变化

1．材料与方法

2．结果

实验二 在PTSD样应激状态下鞘内注射PKCγ阻断剂GF109203X对内脏敏感性／痛行为学的影响

1．材料与方法

2．结果

讨论

第三部分 P2X3在外周水平介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化／去敏化的作用及机制

实验一 PTSD样应激状态下背根神经节P2X3表达动态变化

1．材料与方法

2．结果

实验二 在PTSD样应激状态下鞘内注射P2X3阻断剂TNP-ATP其内脏敏感性／痛行为学的影响

1．材料与方法

2．结果

实验三 PTSD样应激状态下背根神经节P2X3受体电生理学特性的变化

1．材料与方法

2．结果

讨论

全文小结

参考文献

文献综述

攻读硕士期间的发表的文章及研究成果

致谢

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摘要

目的：
　　创伤后应激障碍(PTSD)是指个体经历异乎寻常突发威胁性或灾难性创伤应激事件，导致延迟出现及慢性持续存在的生理、心理障碍。PTSD主要表现为病理性重现，即持续重复体验创伤事件的经历、高度的警觉性、反应麻木与情感淡漠及逃避回忆等特征性症候群。
　　PTSD伴发病、共病多且难治。PTSD与疼痛发生及痛觉敏化/去敏化的形成有密切的关系。PTSD样应激状态下内脏痛觉敏化/去敏感化关联疾病，如PTSD后肠易激综合征(IBS)、膀胱疼痛综合征的发生率呈上升趋势。PTSD样应激可能是IBS内脏痛敏触发、加重的重要因素。既往有关PTSD样应激状态下痛觉敏化/去敏感的研究主要聚焦于大脑的下丘脑、海马、杏仁核、内侧前额叶皮质和前扣带等，但目前以单纯的下丘脑-垂体-肾上腺轴应激理论为靶点开发的药物疗效欠佳。为此，寻找新的有效的治疗靶点有十分重要的价值。新近有研究提示脊髓及背根神经节(DRG)在应激相关的内脏痛觉敏化/去敏化的形成和维持中亦发挥了重要作用，且应激状态下脊髓中枢水平敏化和外周DRG水平敏化的研究逐渐成该研究领域的热点。迄今为止，尚不清楚PTSD样应激状态下内脏敏感改变-痛觉敏化/去敏感的确切分子机制及防治措施。
　　嘌呤核苷酸P2受体亚型3(P2X3)高度选择性地表达于中、小直径DRG神经元中，蛋白激酶Cγ亚型(PKCγ)主要分布于脊髓背的Ⅱ层内侧部及Ⅲ层的交界处。诸多研究证实，PKCγ/P2X3在DRG和脊髓水平介导了疼痛信号的传导及其痛觉敏化的过程。PKCγ在静息时无活性，当受到外界刺激后神经元内Ca2+浓度增加，PKC发生转位而被激活;而PKCγ的激活引起通道电容的改变、多种兴奋性神经递质的释放、疼痛相关受体激活的级联放大效应。既往采用神经病理性痛、炎症性、癌性痛等研究发现，脊髓背角PKCγ的表达明显升高，鞘内给予PKC特异性阻断剂GF109203X可逆转痛觉敏化现象，而在PKCγ基因敲除小鼠未观察到痛觉敏化的发生。既往亦发现P2X3参与了多种痛觉敏化/去敏化的发生，如在神经痛、炎性痛、骨癌痛大鼠模型DRG神经元P2X3表达明显增加，其介导的ATP激活的门控通道电流显著增强;应用P2X3受体激动剂α，β-me ATP可诱导痛觉敏化，而P2X3受体特异性阻断剂TNP-ATP可逆转痛觉敏化，基因敲除鼠的P2X3受体其痛觉反应性降低。另有研究证实，PKCγ/P2X3之间存在相互作用，共同调控痛觉敏化/去敏化的形成。P2X3受体的结构上N末端与PKC结合后，可导致PKC磷酸化;改变P2X3受体上的PKC结合位点或采用PKC抑制剂阻断其作用后，可减少α，β-me ATP诱发的P2X3受体内向电流;PKC的活化可使DRG上α，β-me ATP诱发的P2X3受体电流增加。根据上述理论基础，我们推测:PKCγ/P2X3介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用及机制。旨在为PTSD样应激状态下痛觉敏化/去敏化的临床防治提供新的思路。
　　方法：
　　1.选用健康成年SD雌性大鼠，采用连续单一应激(SPS)联合足底电击建立PTSD样应激状态下内脏敏感性改变的动物模型;
　　2.采用结直肠扩张(CRD)-VMR和AWR评估正常对照组、PTSD术后1、6、7、9、14、21、28、29天时内脏敏感性改变/痛行为学变化;
　　3.采用免疫荧光漂染技术联合激光共聚焦显微技术、Western blot技术研究DRG中P2X3及脊髓背角PKCγ表达水平的动态变化;
　　4.采用鞘内注射PKCγ阻断剂GF109203X和P2X3受体阻断剂TNP-ATP方法，观察GF109203X和TNP-ATP分别对PTSD大鼠内脏敏感性/痛行为学的影响;
　　5.采用全细胞膜片钳技术研究PTSD样应激状态下DRG神经元上P2X3受体电生理特性的改变，及TNP-ATP的抑制作用。
　　结果：
　　第一部分 PTSD样应激状态下VMR和AWR的动态变化
　　采用CRD-VMR和AWR评估正常对照组、PTSD术后1、6、7、9、14、21、28、29天时内脏敏感性改变。在40、60mmHg压力下行CRD时PTSD术后1天组其曲线下面积(AUCVMR)值和AWR值明显低于正常对照组，PTSD术后6天组AUCVMR值和AWR值逐渐恢复至正常水平。然而在PTSD术后7天组，在40、60mmHg压力下时AUCVMR值和AWR值明显升高，并且持续到PTSD术后28天，在PTSD术后9天时AUCVMR值和AWR值达到高峰。在PTSD术后29天组其AUCVMR值和AWR值恢复至正常。
　　第二部分 PKCγ在脊髓中枢水平介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制
　　1.PTSD样应激状态下脊髓背角PKCγ表达的动态变化
　　采用免疫荧光漂染/激光共聚焦显微技术/Western blot技术研究发现:PKCγ阳性产物主要分布于脊髓背角Ⅱ、Ⅲ层。PTSD术后1天组的大鼠PKCγ蛋白的平均荧光强度值(AOD)和Western blot的相对光密度值(ROD)低于正常对照组，PTSD术后6天时表达水平与正常对照组无差异。在PTSD术后7天开始明显升高，第9天时到高峰，且一直持续至28天，差异有统计学意义。其后在PTSD术后29天PKCγ表达开始降低。
　　2.在PTSD样应激状态下鞘内注射不同浓度梯度的PKCγ阻断剂GF109203X对内脏敏感性/痛行为学的影响
　　PKCγ的表达在PTSD术后9天时达到高峰，故选择在PTSD术后9天行鞘内注射PKCγ特异性阻断剂GF109203X，观察不同浓度梯度的GF109203X对大鼠内脏敏感性/痛行为学的影响。结果显示，在PTSD术后9天时鞘内注射低浓度的GF109203X（0.05-0.15 nmol/10μL）时，其AUCVMR和AWR的值与空白对照组没有显著差别。鞘内注射0.30 nmol/10μL浓度的GF109203X在40 mmHg水平压力下行CRD时其AUCVMR值和AWR的值降低，但在60mmHg水平压力下其AUCVMR值和AWR的值与空白对照组没有显著差异。然而鞘内注射0.50 nmol/10μL浓度的GF109203X在40、60mmHg水平压力下行CRD时其AUCVMR值和AWR的值均呈现显著降低，在PTSD术后7、14、21、28天分别鞘内注射0.50 nmol/10μL浓度的GF109203X可以观察到其AUCVMR和AWR的值与空白对照组比较明显降低，这表明GF109203X在0.50nmol/10μL的浓度时可完全抑制PTSD样应激状态下的内脏高敏感现象。
　　第三部分 P2X3在外周水平介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制
　　1.PTSD样应激状态下DRG上P2X3表达的动态变化
　　P2X3高度选择性地表达于与伤害性感受和痛觉有关的中、小直径DRG神经元中。我们对正常对照组，PTSD术后1、6、7、14、21天组大鼠的DRG行免疫荧光染色发现:PTSD术后1天组的大鼠P2X3的AOD值低于正常对照组，PTSD术后6天时表达水平与正常对照组无差异。在PTSD术后7、14和21天时与正常对照组比较均明显升高差异有统计学意义，其中在PTSD术后第7天时达到高峰。
　　2.PTSD样应激状态下P2X3受体特异性阻断剂TNP-ATP对内脏敏感性/痛行为学的影响
　　因为前面实验提示P2X3的表达在PTSD术后7天时达到高峰，故选择在PTSD术后7天行鞘内注射TNP-ATP。在PTSD术后7天行CRD扩张前10分钟时，鞘内注射TNP-ATP其AUCVMR值和AWR值在40 mmHg和60 mmHg可显著降低，与PTSD术后7天对照组比较。
　　3.在PTSD样应激状态下大鼠DRG上P2X3受体电生理特性的变化，α，β-meATP诱发的P2X3内向电流的改变及P2X3受体特异性阻断剂TNP-ATP的抑制作用
　　α，β-me ATP作用于大鼠DRG神经元后可引起Iα，β-meATP的内向电流。与正常对照组比较，PTSD术后7天组，α，β-me ATP可使DRG神经元P2X3受体介导的内向电流幅度明显增强，而选择性P2X3受体拮抗剂TNP-ATP可完全抑制其诱发的内向电流，经5分钟洗脱后TNP-ATP的阻断可完全恢复。
　　结论：
　　1.采用SPS联合足底电击的方法成功建立了PTSD内脏敏感性改变-痛觉敏化/去敏化的动物模型;PTSD样应激状态下内脏敏感性/痛行为学的发生了动态变化，PTSD样应激对VMR和AWR有明显的影响;
　　2.PKCγ在脊髓中枢水平介导了PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制，PTSD样应激状态下脊髓背角PKCγ表达发生了动态变化，鞘内注射PKCγ阻断剂GF109203X可抑制PTSD内脏高敏感性形成，并发挥抗内脏伤害性刺激的镇痛效应;
　　3.P2X3在外周DRG水平介导了PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制;PTSD样应激状态下DRG上P2X3表达发生了动态变化，P2X3受体特异性阻断剂TNP-ATP减轻内脏敏感性/痛行为学反应;在PTSD样应激状态下大鼠DRG上P2X3受体电生理特性的发生了变化。

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