锝99标记的抗白念珠菌芽管单克隆抗体诊断白念珠菌感染的实验研究

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一、目的:
　　随着医疗技术的不断进步，使得许多患者得以益寿延年的同时，侵袭性真菌感染（IFIS）也在显著增多。据文献报道，在目前的侵袭性真菌感染中，虽然由曲霉菌属和非白念的念珠菌属引起的感染有逐年增多的趋势，但临床上仍以白假丝酵母菌导致的侵袭性真菌感染占主要地位。侵袭性白假丝酵母菌感染主要侵及肺脏、血液、脑组织、肾脏、肠道等，临床表现常无特征性，病程进展快，预后差。早期、快速、准确的诊断是保证及时有效治疗和挽救患者生命的关键，遗憾的是，现今的各种诊断方法，均不能很好的满足临床上更早更快更准确的诊断侵袭性白假丝酵母菌感染。另因白假丝酵母菌是条件致病菌，正常人体常有其存在，即使检测到白假丝酵母菌亦需要区别是感染还是定植。现有常规微生物学检查和病理学检查存在不足：直接镜检操作简便,可早期发现病原体,但不易排除污染,难以鉴定种属；分泌物和血的真菌培养结果常有确诊价值,但耗时长且阳性率低,需排除污染和定植,还需注意安全防护；组织病理学检查可发现真菌感染的病理改变以及菌丝或孢子等真菌成分,虽为侵袭性真菌感染的确诊依据,但经常难以鉴别种属,且属有创检查,患者接受度低。影像学检查特异性低，难以和细菌、肿瘤区别。血清学试验如真菌特异性抗原研究包括半乳甘露聚糖等用于念珠菌病和侵袭性曲霉菌病诊断显示有一定价值，但存在难以避免的交叉反应以及试剂标准化等问题。白假丝酵母菌循环抗体的检测如P47抗原的抗体，有一定意义，但循环抗体出现时间较迟，免疫功能受到抑制的患者可能测不出相应抗体;且仍需排除是否定植；分子生物学诊断技术如PCR，该方法灵敏，但过程缺乏规范化，检测的敏感性和特异性报道不一，且不能帮助判断检测的阳性结果是感染还是定植，在检测过程中易出现假阳性和假阴性。有学者通过检测真菌特异性代谢物进行诊断，但由于不同菌株产生代谢物能力差别很大，同时受体内代谢物及其他微生物代谢物的干扰，加之检测所需的仪器设备要求较高，故临床应用受到限制。综上所述，目前侵袭性白假丝酵母菌感染的早期快速诊断仍十分困难。
　　放射性核素显像已广泛用于多种疾病的诊断，但应用于真菌感染早期诊断还是一个全新的研究领域，近来有学者对此做了一些尝试性的工作。如锝99标记的抗菌肽，锝99标记的聚乙二醇脂质体，锝99标记氟康唑，锝标记的几丁质结合蛋白（CBP21）来检测真菌感染。前两种标记物虽可在炎症部位浓聚，但不能区分白假丝酵母菌感染和细菌感染；后两种标记物可在白念感染部位浓聚，明显区别于细菌感染及无菌炎症。但这两种标记物所检测到的白假丝酵母菌究竟是定植还是感染仍无法判断。
　　白假丝酵母菌是一种双相性真菌,研究发现，白假丝酵母菌由酵母相转变为菌丝相过程中形成芽管，芽管的形成增强了白假丝酵母菌对组织的定植、侵袭以及逃避宿主抵抗力的能力，使其对机体组织更具有侵袭力，毒力明显提高。因此普遍认为，芽管的形成是该菌由定植菌向致病菌转变的标志。由此可以推断，检测到抗芽管、菌丝相的抗原便可确诊侵袭性白假丝酵母菌感染。MAb03.2C1-C2为我科实验室自行制备的特异性针对白假丝酵母菌芽管壁外膜的单克隆抗体。研究表明该单抗能识别白假丝酵母菌芽管胞壁外膜抗原,而不能识别其孢子相抗原，且不与其他念珠菌属及曲霉发生交叉反应；利用其特异性来检测侵袭性白假丝酵母菌感染有一定意义。
　　本研究制备了抗白假丝酵母菌芽管单克隆抗体MAb03.2C1-C2及其Fab’片段，用放射性核素锝99进行标记，探索其检测侵袭性白假丝酵母菌感染的可行性，并为日后开展放射性核素显像检测侵袭性真菌感染提供实验基础。
　　二、方法:
　　1．抗白假丝酵母菌芽管单克隆抗体MAb03.2C1-C2及其Fab’片段的制备：采用辛酸-硫酸铵法(CA—AS)和DEAE离子交换层析法提纯腹水单抗MAb03.2C1-C2，再用木瓜蛋白酶法和DEAE离子交换层析法制备Fab’，采用蛋白电泳检测其分离效果及纯度，间接免疫荧光实验鉴定其活性。
　　2.锝99标记抗白假丝酵母菌芽管单克隆抗体MAb03.2C1-C2 Fab’：采用用2-亚氨基噻吩盐酸盐(2-IT)修饰MAb03.2C1-C2 Fab’，用99Tcm-葡庚糖酸钠转换络合标记法标记IT-MAb03.2C1-C2 Fab’，3MM色谱纸层析测定放射化学纯度，应用正交试验设计方法筛选最佳标记条件。
　　3．锝99标记抗白假丝酵母菌芽管单克隆抗体MAb03.2C1-C2 Fab’的体外稳定性鉴定：通过室温稳定性实验，评价标记物的理化性质。
　　4．锝99标记抗白假丝酵母菌芽管单克隆抗体MAb03.2C1-C2 Fab’在健康家兔体内的示踪动力学研究：取6只日本雄性大耳白兔，经耳缘静脉注射0.1ml（37 MBq）纯化后的99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’溶液，然后分别于1.5、3、5、10、30、60、120、240、480 min从兔对侧耳缘静脉采血0.1ml，注入试管并称重，γ计数器测量放射性计数，所测结果经探测测量效率校正，换算为放射性浓度(KBq/L)。运用药代动力学分析软件（DAS2.1.1版）分析最佳房室模型，得出药代动力学参数。
　　5．锝99标记抗白假丝酵母菌芽管单克隆抗体MAb03.2C1-C2 Fab’在健康小鼠体内分布及显像研究：将0.2ml（74 MBq）99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’溶液用生理盐水稀释至500 ml，混匀后，分别取1 ml置于5只放免管中，用γ免疫计数器测各管放射性计数，取平均值乘以500，即得到参考源的放射性计数。按随机数字表法随机取35只成年昆明小鼠分为5组，每组7只。每只经尾静脉注射7.4 MBq99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’溶液，分别于10、30、60、120、240 min摘眼球法取血，然后将小鼠以颈椎脱臼法处死，收集心、肝、肺、肾、肠、骨、脑、肌肉，称重，测量放射性计数，经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。
　　6．锝99标记抗白假丝酵母菌芽管单克隆抗体MAb03.2C1-C2 Fab’与真菌、细菌、肿瘤细胞的体外结合研究：将370KBq99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’，分别加入含1m浓度为l×l07/ml的白假丝酵母菌孢子悬液、加热灭活白假丝酵母菌孢子悬液、白假丝酵母菌芽管悬液、烟曲霉菌悬液、大肠杆菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液，A549细胞悬液的带塞离心管中，4℃孵育12h。离心，弃上清。灭菌注射用水洗涤三次，γ免疫计数器测量各管沉淀物的cpm。
　　7.99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’在真菌/细菌感染大鼠及荷瘤裸鼠体内显像及竞争结合显像研究：取白假丝酵母菌/真菌、细菌感染大鼠及荷A549裸鼠固定于木制板上，经尾静脉分别注射99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’溶液37MBq和18.5 MBq，于30min后开始0采集图像，观察感染部位及肿瘤组织放射性分布动态变化。取另一只白假丝酵母菌感染大鼠，尾静脉注射0.5 mg MAb03.2C1-C2 Fab’1h后，再注射99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’溶液37 MBq，观察MAb03.2C1-C2 Fab’对白假丝酵母菌感染部位显像的抑制作用。
　　三、结果:
　　1. MAb03.2C1-C2 Fab’的制备：成功制备了纯度91.6％的MAb03.2C1-C2 Fab’，分子量为43kb，其仅与白假丝酵母菌芽管或菌丝特异性地结合,与白假丝酵母菌的孢子不发生结合。
　　2.99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’的制备：99Tcm标记MAb03.2C1-C2 Fab’的最佳反应条件为：30μl的2-IT-Fab’加入74MBq(0.2ml)99mTc-GH溶液中，室温下反应30min. Whatmann3MM纸层析，γ计数器测量标记混合物各放射性组分在生理盐水、氨水及丙酮3种流动相中的比移值(Rf值)。本方法制备的99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’的标记率为(84.92±2.46)％，经纯化后，标记率>95％。直接法计算其比活度为(3.54±0.03)TBq/mmol。
　　3．99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’的体外稳定性：标记物室温下放置8 h，标记率仍大于95％，为(91.66士1.06)％。
　　4．99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’在健康家兔体内的示踪动力学分析：标记多肽的家兔体内动力学过程符合权重为1的二室模型，t1/2α为1.21±0.77 min，t1/2β为84.45±2.65 min，清除率(CL)为1.00±0.00 ml/min。
　　5．99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’在健康动物体内的生物分布及显像：标记物在健康小鼠体内清除较为迅速，肾脏、肝脏及肺分布较多。
　　6．99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’体外结合研究：99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’显著的聚集于白假丝酵母菌芽管中，明显区别于白假丝酵母菌孢子，烟曲霉孢子，加热灭活白假丝酵母菌孢子，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及A549细胞。
　　7.99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’在白假丝酵母菌感染大鼠及荷A549裸鼠体内显像：白假丝酵母菌感染鼠尾静脉注入99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’0.5h后，大鼠感染白假丝酵母菌的肌肉部位开始出现放射性浓聚，1 h时浓聚更为明显，而注射过加热灭活过白假丝酵母菌的肌肉部位和烟曲霉感染部位、大肠杆菌感染部位、金黄色葡萄球菌感染部位没有明显聚集，T／NT比值较高。荷A549裸鼠体内分布显示，99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’在肿瘤部位无明显聚集。竞争抑制实验显示：在提前注射未标记的MAb03.2C1-C2 Fab’后，白假丝酵母菌感染部位影像明显减淡。
　　四、结论:
　　1．本研究制备的MAb03.2C1-C2 Fab’保留了原单抗的抗原特异性，可特异性的和白假丝酵母菌芽管结合。
　　2．本研究制备的99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’经纯化后标记率＞95％，具有良好的体内外稳定性。
　　3．99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’在健康动物体内具有良好的体内分布及示踪动力学特性，血液清除较快，通过肾脏及肝脏双重途径排泄。
　　4．99Tcm-MAb03.2C1-C2 Fab’特异性浓聚于白假丝酵母菌感染组织，显像清楚，且T/NT比值较高，为早期诊断侵袭性白假丝酵母菌感染提供了一种新的特异性的显像剂。

著录项

作者
葛兰;
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作者单位

第三军医大学;

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授予单位第三军医大学;
学科皮肤性病学
授予学位博士
导师姓名郝飞;
年度 2011
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总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类皮肤念珠菌病;在诊断上的应用;
关键词
白念珠菌感染; 放射性核素显像; 锝99标记; 单克隆抗体诊断; 显像剂;

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