HBV感染后表型相关单卵孪生子基因组CpG岛差异甲基化基因的筛查

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乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，慢性感染约3.5亿人，从急性-过性感染、慢性感染、重型化、肝硬化、肝细胞癌到肝功能衰竭等形成复杂的疾病谱。影响HBV感染后易感及转归的因素很多，包括宿主因素(种族、性别、年龄、基因多态性、免疫状态)，病毒因素(基因型、准种复杂性、其他病毒如HCV、HDV、HIV的重叠感染等)，环境因素(饮酒、行为和习惯、生活环境)等，具体机制不清。研究发现宿主因素在乙型病毒性肝炎的疾病表型中具有重要的作用。孪生子研究一直是遗传学与表型研究中的重要方法。单卵孪生子(monozygotictwins，MZtwins)，两者共享基因型和早期发育环境，常表现出惊人的时空反应一致性，在多种疾病中表现出同病(comorbidity)和疾病表型一致性(concordance)，遗传学通常利用MZ孪生子初步判断遗传因素对表型的影响，例如复杂疾病、心理、性格、行为等。我们在临床研究中发现，HBV感染后MZ孪生子也可以表现出表型不一致，且病毒因素的作用不大。最近的研究也提示大多数MZ孪生子的遗传特性并不是完全相同，归因于伴随着MZ孪生子一生的表观遗传学漂移(epigeneticdrift)现象，即胚胎形成期的基因组印迹差异以及后天环境影响所致的表观遗传学修饰的累积。表观遗传学现象是指在生物的减数分裂和有丝分裂中无DNA序列变化的基因表达的稳定的可遗传的改变，包括DNA甲基化(DNAmethylation)、组蛋白修饰(histonemodification)，及其导致的基因组印迹、基因沉默(gene)、X染色体失活/重构等，在基因表达调控、生殖发育、遗传进化以及生理病理现象中有密切的生物学意义，目前，表观遗传学研究及表观基因组研究已成为近年关注的热点问题。DNA的甲基化是基因组印迹的主要形式。CpG岛(CpGislands)甲基化后，基因表达受抑制而沉默。DNA的甲基化对哺乳动物的正常发育有重要的调控作用，并且这种调控很大程度上是通过CpG岛的甲基化和去甲基化起作用的。因此，全基因组DNA甲基化谱(methylome)的研究将增进我们对基因调控和人类基因组的认识。探索HBV感染后表型不一致相关的基因组CpG岛甲基化差异，有望为认识慢性HBV感染相关的表观遗传易感机制提供初步的思路。 2001年8月至2005年12月，我们共收集随访36对HBV感染孪生子，20对孪生子在本人攻读硕士期间已经做了初步的表型研究。我们目前主要是对新增的16对孪生子进行初步的表型分析。再结合硕士期间的研究发现，以期对HBV感染孪生子的临床表型分析有一个全面的认识。首先进行孪生子卵型鉴定，结合肝功、HBVDNA定量检测、HAV～HEV血清学标志物、主要症状、体征等进行临床表型分析，建立表型差异模式。在表型不一致MZ孪生子组进行病毒因素，包括HBV基因型和准种(quasispecies)复杂性的筛查，结合病史资料明确感染源、感染时间、感染途径，确定表型差异中病毒因素是否起主要作用。对于病毒因素在HBV感染后MZ孪生子表型差异中作用不大的孪生子对，探讨表观遗传学机制对其疾病表型的影响。本研究主要采用基于全基因组CpG岛差异甲基化检测的两种方法：甲基化间区位点扩增(AIMS)和甲基化CpG岛扩增结合代表性差异分析(MCA-RDA)技术进行HBV感染后表型相关的全基因组CpG岛差异甲基化分析。两种方法中，前者侧重于获得差异甲基化图谱(methylome)，后者侧重于获得差异甲基化条带。对两种方法所获得的差异甲基化条带进行克隆、测序以及一系列的生物信息学分析后，初步建立HBV感染表型相关的候选差异甲基化基因库。 AIMS技术的原理在于以甲基化敏感和甲基化不敏感的同裂酶(isoschizomers)裂解基因组DNA后，加接头(adaptor)并以接头引物特异性PCR技术扩增甲基化间区序列，此方法可通过接头引物控制扩增带的复杂程度，且所得片段在200～2000bp之间，可以直接克隆到T载体并测序。采用MCA-RDA技术对10对HBV感染后表型不一致和5对表型一致MZ孪生子进行了表型相关的差异甲基化基因的筛查分析。在初筛的差异甲基化候选基因库中，进一步进行一系列生物信息学分析，如CpG岛搜索预测、CpG岛启动子区预测、基因的初步功能预测(OMIM)、甲基化数据库信息比对(MethDB)、人类印迹基因数据库、人类癌症基因组剖析计划(CGAP)数据库信息比对等，确定了差异甲基化候选基因。对候选的差异甲基化基因采用基因组DNA亚硫酸氢盐修饰-甲基化特异性PCR扩增-跨目的片段两侧约100～200bp片段长度的PCR扩增产物直接测序的研究策略，进行候选差异甲基化基因的甲基化状态分析。我们的主要研究结果如下： 1.采用28个STR多态性位点进行基因扫描，总计36对孪生子中，双卵孪生子(dizygotictwins,DZtwins)9对、MZ孪生子27对。表型分析发现17对MZ孪生子疾病表型不一致，10对MZ孪生子疾病表型一致。 2.本研究对AIMS技术进行了改良，针对CpG岛的核心序列(-CGCG-和-CCGG-)，选择BssHⅡ-PauⅠ/BsePⅠ同裂酶针对-CGCG-位点，选择HpaⅡ-MspⅠ以及SmaⅠ-XmaⅠ同裂酶针对-CCGG-位点，三组同裂酶的使用均可达到分离差异甲基化条带的目的，提高了基因组CpG岛甲基化位点的覆盖率。 3.改良AIMS方法研究显示，①MZ孪生子两两之间(无论表型一致与否)基因组CpG岛DNA均存在差异甲基化现象，证实了MZ孪生子存在表观遗传学漂移现象；②但是表型不一致组差异甲基化条带比例高于表型一致组，表明表观遗传学漂移的累积效应确实对表型产生了影响。③表型不一致MZ孪生子组平均年龄为25岁，而表型一致的MZ孪生子组平均年龄为6.5岁，因此证实了表观遗传学漂移与年龄相关，随着年龄增长出现的表观遗传学修饰的累积，导致了疾病表型的显著差异。 4.MCA-RDA方法研究显示，两套接头引物差异条带的钓取能力存在明显的差异，由于CpG岛甲基化间区GC含量较高，所以针对高GC含量目的片段的MCA系列接头能更好的分离差异条带。每份样本经3～4轮竞争性杂交及正反双向杂交后，琼脂糖凝胶电泳分离到约200bp～500bp大小不等的差异甲基化条带45个，片段大小多集中于±200bp，所有差异条带均成功回收、并克隆。 5.在差异甲基化条带的筛查和分离能力方面对MCA-RDA及改良AIMS这两种方法进行了比较，MCA-RDA技术原理简单，即将甲基化的CpG岛进行扩增作为复制子，进行竞争性杂交，操作上不需要特殊平台，但由于需要多次扩增复制子，因此必须高保真DNA聚合酶以确保分析序列的精确。 6.经分析发现部分差异甲基化基因存在表型相关特异性，某些差异甲基化基因只出现在HBV感染后表型不一致的MZ孪生子组；也有一些差异甲基化基因只与表型一致的MZ孪生子相关；此外，也存在一些基因并无特异性，在表型不一致组及表型一致组均存在。采用MCA-RDA正反向双向杂交技术显示，存在表型一致或表型不一致相关的孪生子双方的共同优势基因，以及只在孪生子一方出现的基因。对于只在表型不一致MZ孪生子组出现的差异甲基化基因以及表型不一致相关的MZ孪生子间共同的优势基因，进行后续的研究，成功的可能性大。 7.对所有的测序结果进行一系列生物信息学分析，初步的BLAST分析明确了已知基因及未知基因；结合现有的基因组织表达数据库(癌症基因组剖析计划数据库，CGAP)资料进行分析，在肝组织和/或外周血单核细胞中表达的基因，由于可能在功能上与乙型病毒性肝炎的致病机制相关，被列为候选基因。综上所述，我们对近期收集的16对孪生子加上前期的20对孪生子，共计36对孪生子进行了卵型鉴定和临床表型研究。并对可能影响疾病表型的病毒学因素进行了筛查。排除了病毒学因素的干扰后，在表型一致和表型不一致的MZ孪生子间进行了差异甲基化基因的筛查，通过两种目前比较成熟的筛查方法(改良AIMS技术及MCA-RDA技术)进行了研究，MZ孪生子，无论表型一致与否，均存在甲基化谱的差异，证实了表观遗传漂移现象的存在；且发现随着年龄的增长，表观遗传学修饰具有累积效应；测序217个克隆，获得候选基因41个，初步的功能预测确定了最可能的9个候选基因，这些差异甲基化基因既然与MZ孪生子HBV感染后表型不一致相关，可能作为表观遗传易感基因参与乙型肝炎致病机制；由于DNA差异甲基化状态与父本或母本印迹差异有关，所以在这些候选基因中可能找出生理状态下起作用的新印迹基因；为进一步进行HBV慢性感染的表观遗传学机制研究提供依据，候选差异甲基化基因中是否存在关键的表观遗传易感基因?还是表观遗传学修饰的漂移造成了多个影响乙型病毒性肝炎表型的微效基因的改变所导致基因功能的改变以致表型差异?均有待进一步深入研究。在分析得到的41个候选基因中，有19个基因是未知基因或功能不清楚，对于这些基因有进一步挖掘的潜力，如对于这些基因进行组织表达特异性分析，了解其是否与肝炎发病机制相关等。

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作者
徐宝艳;
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作者单位

第三军医大学;

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授予单位第三军医大学;
学科内科学(传染病)
授予学位博士
导师姓名王宇明;
年度 2006
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类医学遗传学;
关键词
HBV感染; 孪生子; 表型; 甲基化谱; 表观遗传学; 甲基化间区位点扩增;

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