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人配子、种植前胚胎及体外成熟卵来源桑椹胚全基因组CpG岛及启动子的甲基化模式

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摘要

前言

第一部分 人配子、种植前胚胎全基因组CpG岛及启动子甲基化动态变化图谱

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 IVM及IVO桑椹胚CpG岛及Promotor区甲基化模式比较

前言

材料与方法

结果

讨论

全文小结

展望与不足

参考文献

中英文缩写词对照表

致谢

声明

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摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分人配子、种植前胚胎全基因组CpG岛及启动子区域甲基化动态变化图谱
　　研究目的：
　　本研究采用几乎完全覆盖启动子和CpG岛（大部分甲基化发生区域）甲基化芯片法(MeDIP-Chip)分析人精子、卵母细胞及种植前胚胎各发育阶段全基因组CpG岛及启动子区域甲基化动态变化情况，以了解CpG岛及启动子甲基化的动态变化模式、该甲基化动态变化的可能调节机制及在早期胚胎发育过程中的功能。
　　研究方法：
　　经医院伦理委员会批准，收集2010年7月-2013年7月于广州医科大学附属第三医院生殖医学中心助孕的患者，卵母细胞来自助孕患者及自愿者捐赠，精子来自助孕患者，原核及2-4cell胚胎来自自愿者捐赠获得卵子受精后所得，其余早期胚胎来自助孕妊娠成功患者的捐赠，所有标本的使用得到了捐赠者的知情同意。
　　分组
　　标本按发育阶段分为8组，①精子组，标本30份;②MII期卵细胞组:25枚;③2PN期合子，25枚;④4细胞期胚胎，5枚;⑤8细胞期胚胎;4枚;⑥桑椹胚胚胎;6枚;⑦5枚囊胚的ICM(内细胞团);⑧5枚囊胚的TE(滋养层细胞)。
　　DNA的提取
　　①精子采用差异裂解法，并结合使用Genomic DNA urification Kit(Promega)的试剂盒提取精子DNA;②-⑥组，卵及囊胚前期胚胎使用酸性Tyrode's solution去除透明带及粘附的颗粒细胞，移入PCR管裂解细胞提取DNA;⑦和⑧囊胚的ICM(内细胞团细胞)与TE(滋养层细胞)，用拉细的巴氏管钝性分离ICM与TE后，分别移入PCR管裂解细胞收集DNA。
　　(3)甲基化芯片(MeDIP-Chip)
　　各组DNA采用超声波将DNA碎裂成大小约200-1000 bp的随机片段，经鼠5-甲基单克隆抗体进行免疫沉淀、纯化后，采用Cy3和Cy5标记WGA试剂盒进行全基因组扩增，然后与包含了NimbleGen人DNA甲基化3x720k启动子和CpG岛的微阵列杂交，用GenePix4000B微阵列扫描仪读取数据。
　　研究结果：
　　(1)提取DNA的纯度及免疫共沉淀所富集的DNA片段均符合实验要求。
　　(2)人配子、种植前胚胎全基因组CpG岛甲基化独特的动态变化模式
　　①精子的全基因组CpG岛的甲基化程度最高(sperm，n=15604)，受精后由原核期开始逐步去甲基化(2PN，n=3744)，4cell期胚胎时全基因组CpG岛的甲基化程度达最低(4cell，n=2826)，8cell胚胎期(8cell，n=3073)后CpG岛甲基化水平逐步恢复重建，桑椹胚期CpG岛甲基化水平进一步升高(Morula，n=5374)直至囊胚期ICM(ICM，n=5706)的CpG岛甲基化水平接近卵母细胞水平(Oocyte，n=6062)，而TE细胞CpG岛甲基化水平处于卵母细胞与精子之间(TE，n=8376)。
　　②种植前胚胎全基因组CpG岛甲基化的动态变化主要区域在高甲基化(Peak Mvalue≥0.7)和低甲基化(Peak Mvalue≤0.4)区域。
　　③种植前胚胎基因组CpG岛的甲基化程度的变化，存在三个剧烈变化期。
　　这种变化的趋势为:第一期为精子、卵母细胞受精后到2PN的转变，即精子及卵母细胞甲基化程度降低（迅速去甲基化）;第二期:桑椹胚到囊胚期的转变，甲基化的迅速重建，第三期囊胚形成过程中细胞向ICM与TE分化阶段，且TE的甲基化重建程度大于ICM。
　　(3)人种植前胚胎全基因组promoter甲基化水平的动态变化情况。
　　研究结论：
　　(1)人种植前胚胎全基因组CpG岛甲基化呈独特的动态变化模式:受精后由原核开始逐步去甲基化，4cell期全基因组CpG岛的甲基化程度最低，之后逐步重新建立甲基化模式;囊胚期ICM甲基化水平接近卵母细胞，而TE的甲基化水平处于卵母细胞与精子之间;而人及哺乳动物种植前胚胎在全基因组的总体甲基化水平最低点在ICM阶段。
　　(2)基因组在不同发育阶段种植前胚胎CpG岛的甲基化存在三个剧烈变化期，CpG岛甲基化擦除的主要阶段是4cell期，而全基因组总体的擦除则在2cell期。
　　(3)基因组CpG岛甲基化动态变化主要由Promotor区域CpG岛甲基化动态变化引起。
　　第二部分IVM及IVO桑椹胚CpG岛及启动子甲基化模式比较
　　研究目的：
　　本研究通过对IVM来源处于细胞融合期，即合子基因组启动活化的关键时期---桑椹胚及体内成熟(In vivo maturation IVO)来源的桑椹胚全基因组CpG岛及启动子甲基化情况进行配比分析，从表观遗传学的角度来评价IVM胚胎发育潜能低下的可能机制及安全性。
　　研究方法：
　　(1)实验对象
　　实验组:收集2012年1月至2013年12月，ICSI患者和短时受精患者的MⅠ期卵子168枚，IVM成熟的卵受精后一部分进行桑椹胚培养，提取桑椹胚DNA进行甲基化芯片实验;一部分行囊胚培养，行发育潜能观察实验。
　　对照组:形态学观察的对照组来自2012年1月-2013年12月期间以男性因素行ICSI治疗患者，且男方精液参数主要为少弱精且无女方因素;共100枚MⅡ卵母细胞。甲基化芯片(MeDIP-Chip)对照组来自第一部分实验组第⑥组的桑椹胚。
　　(2)胚胎培养: MⅠ期卵子放置低氧分压的三气培养箱，成熟卵母细胞行ICSI受精，进行桑椹胚及囊胚培养，对照组患者的MⅡ卵母细胞受精后行全胚胎囊胚培养。
　　(3)来自IVM与IVO的桑椹胚先使用酸性Tyrode's solution去除透明带及粘附的颗粒细胞，移入PCR管裂解细胞提取DNA进行甲基化芯片(MeDIP-Chip)实验，实验方法与第一部分实验一致。
　　研究结果：
　　1.IVM卵母细胞共168枚，体外成熟率为83.3％(140/168)，40枚成熟卵受精后进行桑椹胚培养，共获得6枚碎片＜20％桑椹胚进行DNA提取后进入甲基化芯片实验;其余100枚成熟卵受精后进行囊胚培养参与发育潜能评估实验，两组的2PN率、卵裂率及桑椹胚形成率无统计学差别（P＞0.05），但优质囊胚形成率IVM组(11.4％)显著性低于IVO组(46.7％)(P＜0.01)。
　　2.CpG岛方面
　　(1)IVM桑椹胚全基因组CpG岛高甲基化的比例高于IVO桑椹胚，相反低甲基化区域的比例却低于IVO桑椹胚。
　　(2)来自IVM桑椹胚甲基化的信号总数(n=3281)多于IVO桑椹胚甲基化的信号总数(n=611);
　　(3)IVM桑椹胚的Intragenic、intergenic及Promotor各区域的peakMvalue平均值均高于IVO桑椹胚。
　　3.Promotor方面:
　　(1) IVM桑椹胚全基因组Promotor高甲基化的比例高于IVO桑椹胚，但中、低甲基化区域的比例低于对照组。
　　(2)来自IVM桑椹胚甲基化的信号总数(n=3447)多于IVO桑椹胚甲基化的信号总数(n=2744)。
　　研究结论：
　　1、两组的2PN率、卵裂率及桑椹胚形成率无统计学差别，但优质囊胚形成率IVM组显著性低于IVO组，证实源自促排后的未成熟卵胚胎发育潜能低下。
　　2、来自体外成熟卵的桑椹胚与来自体内成熟卵的桑椹胚，在全基因组CpG岛及Promotor区甲基化表水平上均出现较大的差异: IVM桑椹胚CpG岛甲基化的水平高于IVO桑椹胚，IVM桑椹胚Promotor区甲基化的程度高于IVO桑椹胚，表观遗传学上的差异可能是导致促排后的未成熟卵胚胎发育潜能差、妊娠率低下的主要原因，因此这部分卵母细胞在临床上须谨慎运用。
　　全文小结：
　　1、受精后由原核开始的逐步去甲基化，CpG岛4cell期最低，启动子区域在桑椹胚期降至最低;
　　2、种植前期胚胎不同发育阶段全基因组的CpG岛及启动子的甲基化存在三个剧烈变化期;
　　3、全基因组CpG岛甲基化动态变化主要由Promotor区域CpG岛甲基化动态变化引起，HCP、LCP对人种植前胚胎全基因组promoter甲基化的动态变化的影响大于ICP;
　　5、促排后的未成熟卵经体外成熟培养后获得的胚胎发育潜能低下;
　　6、源自体外成熟卵与体内成熟卵的桑椹胚，在全基因组CpG岛及Promotor区甲基化水平上均出现较大的差异:该差异可能是导致IVM胚胎发育潜能差、妊娠率低下的主要原因。

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