EPO促脑神经血管单元细胞生长及补肾益精方药促EPO生成作用研究

代理获取

页面导航

目录
摘要
著录项
相似文献
相关主题

摘要

背景：中医理论认为，肾为先天之本。“肾藏精”为代表的精气学说是中医药学的重要基础理论。肾所藏先天之精，主生长发育和生殖，是人体生长发育的根本；肾所藏后天之精，是维持生命的精微物质，与人体生长壮老已过程密切相关。肾中精气可以化髓，髓充于脑，“补肾益精健脑”是中医治疗衰老的经典方法，疗效独特而显著。中枢神经退行性疾病的发病率日益渐长，临床上通过补肾益精来治疗脑部疾病的应用将越来越多，而“肾精”的物质基础至今未明。
　　根据促红细胞生成素（EPO)的来源和作用，我们假设“EPO可能是‘肾精的生物学物质基础，EPO对脑细胞的保护和促进作用可能是‘肾精通于脑’的生物学作用机制”。本研究拟采用课题组自主建立的大鼠3种脑细胞共培养的“脑神经血管单元”体外模型和中药血清药理学的方法，观察EPO对脑神经细胞生长的促进作用，以及补肾益精方药对EPO生成和对脑神经细胞生长的促进作用，用以验证其假说。本课题获得了国家自然科学基金面上项目（81472549)、教育部博士点基金（20110182110012)、重庆市卫生局重大项目（渝中医2010-1-4)的支持。
　　目的：观察外源性EPO对脑神经血管单元中细胞的促生长作用，以及补肾益精药通过促EPO分泌而起到促进脑神经血管单元中细胞生长的作用，为EPO可能为肾精物质基础提供实验依据。
　　方法：
　　1.脑血管神经单元体外模型验证EPO对脑细胞的促生长增殖作用在课题组前期建立的3种大鼠脑细胞共培养“脑神经血管单”体外模型中，加入外源性EPO，设空白对照，每组设6个复孔，常规培养，用MTT法分别测模型中神经胶质细胞、脑微血管内皮细胞的生长曲线，流式检测细胞生长周期，显微镜下微尺测量神经元轴突长度，蛋白免疫印迹测定神经元轴突生长蛋白GAP-43表达。
　　2.试验用右归饮、熟地黄、制首乌水煎液质量控制
　　试验用药水煎液质量控制:①右归饮：马钱苷含量测定色谱条件：色谱柱为ODS C18柱，流动相：乙腈：水（15:85)，检测波长为240nm。肉桂醛含量检测条件：色谱柱为ODS C18柱，流动相为乙腈:水（35:65)，检测波长为290nm,流速为1mL/min'柱温30℃。毛蕊花糖苷含量测定条件：同熟地黄中。②熟地黄：毛蕊花糖苷含量测定条件：色谱柱为ODS C18柱，以（乙腈:0.1％醋酸=15:85)为流动相，检测波长（334nm)，流速1mL/min_1，柱温30℃。③制首乌：二苯乙稀苷含量测定色谱条件：色谱柱为ODS C18柱，以乙腈:水(20:80)为流动相；检测波长320nm，流速为1mL/min-1。
　　3.脑神经血管单元模型验证补肾益精方药促EPO分泌和促脑细胞生长作用在上述3种脑细胞共培养的“脑神经血管单元”体外模型上，分别加入大鼠含药血清，设空白大鼠血清对照，取培养上清液，检测EPO的分泌。分别提取模型中3种细胞蛋白，用WB方法检测EPOR蛋白的表达。用MTT法分别检测模型中神经胶质细胞、脑微血管内皮细胞的生长曲线，BrdU标记法检测细胞生长状况。
　　4.缺氧缺糖复氧损伤对脑神经血管单元模型中EPO/EPOR表达影响及补肾益精方药的保护作用在上述3种脑细胞共培养的“脑神经血管单元”体外模型上，设正常培养组、缺氧缺糖/复氧组、空白大鼠血清+缺氧缺糖/复氧组、补肾益精方药含药血清+缺氧缺糖/复氧组，缺氧6h复氧12h损伤后，采用MTT法检测细胞存活率，采用W B方法检测三种细胞中EPO/EPOR蛋白的表达。
　　结果：
　　1.外源性EPO对神经血管单元模型中神经元轴突生长具有显著促进作用与空白对照组相比，外源性EPO12.5U/mL组、25U/mL组神经元轴突生长显著增加，神经元轴突生长蛋白GAP-43表达显著增多（均P<0.05)。提示EPO能显著促进神经元轴突生长。
　　2.外源性EPO对脑神经血管单元中星形胶质细胞和内皮细胞的周期有显著促进作用与空白对照组相比，外源性EPO25U/mL组能显著升高星形胶质细胞和微血管内皮细胞的DNA合成期（S期）和DNA合成后期（G2)期细胞比例(P<0.05)。提示EPO能显著促进星形胶质细胞和微血管内皮细胞增殖。
　　3.右归饮、熟地黄及制首乌含药血清能显著促进正常“脑神经血管单元”中脑细胞生长并有促EPO分泌趋势
　　3.1 补肾益精药对正常脑神经血管单元的细胞具有显著促生长增殖的作用与5%空白大鼠血清组比较，5%右归饮含药血清组、5%制首乌含药血清组和5%熟地黄含药血清组在48h脑神经血管单元模型中星形胶质细胞显著增加（P<0.05)。与10%空白大鼠血清组比较，10%右归饮含药血清组、10%制首乌含药血清组和10%熟地黄含药血清组在48 h脑神经血管单元模型中微血管内皮细胞显著增加(P<0.05)。表明补肾益精药促进脑神经血管单元模型的星形胶质细胞和微血管内皮细胞增殖。
　　3.2 补肾益精药有促进正常脑神经血管单元的细胞中EPO分泌及EPOR表达趋势与空白血清对照组比，右归饮、制首乌与熟地黄含药血清均有促进脑神经血管单元模型中神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞EPO分泌增加和细胞中EPOR表达增加的趋势，但差异均未达到显著性意义（P>0.05)。
　　4.补肾益精药对脑神经血管单元模型中三种细胞缺氧缺糖/复氧损伤具有显著保护作用
　　4.1 补肾益精方药能显著提高缺氧缺糖/复氧损伤星形胶质细胞和微血管内皮细胞存活率与正常组细胞相比，缺氧缺糖/复氧损伤模型组星形胶质细胞存活率显著降低（P<0.01)，与模型组相比，5%空白大鼠血清组星形胶质细胞，10%空白大鼠血清组微血管内皮细胞的存活率均显著升高（均P<0.01)。与5%空白血清组相比，缺氧缺糖/复氧损伤后5%右归饮含药血清组、5%熟地黄含药血清组星形胶质细胞的存活率均显著升高（均P<0.05)。与10%空白大鼠血清组相比，缺氧缺糖/复氧损伤后10%右归饮含药血清组、10%熟地黄含药血清组微血管内皮细胞的存活率均显著升高（均P<0.05)。提示右归饮、熟地黄提高缺氧缺糖/复氧损伤星形胶质细胞和微血管内皮细胞存活率。
　　4.2 补肾药对脑神经血管单元模型中三种细胞缺氧缺糖/复氧损伤中EPO/EPOR表达影响与正常组相比较，缺氧缺糖/复氧损伤后，三细胞共培养模型损伤组中神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞中EPO/EPOR的表达量极显著降低(P<0.01)。与损伤模型组相比较，5%空白大鼠血清组3种细胞的EPO/EPOR的表达均显著升高（均 P<0.05)。与5%空白血清组相比较，5%右归饮含药血清组、5%熟地黄含药血清组三细胞共培养损伤模型中3种细胞EPO/EPOR的表达均显著升高（均P<0.05)。与10%空白血清组相比较，10%右归饮含药血清组、10%熟地黄含药血清组三细胞共培养损伤模型中3种细胞的EPO/EPOR的表达均显著升高（均P<0.05)。制首乌含药血清未有显著的提高三细胞共培养损伤模型中3种细胞EPO/EPOR的表达（均P>0.05)。提示右归饮、熟地黄对缺氧缺糖/复氧损伤的脑神经血管单元保护作用，其作用与增加EPO/EPOR的表达有关。
　　结论：
　　1.外源性EPO对脑神经血管单元模型中神经元的轴突生长，星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞增殖有显著促进作用。
　　2.右归饮、熟地黄、制首乌对正常脑神经血管单元中3种细胞具有促进生长与增殖的作用，同时有促进细胞分泌EPO和细胞中EPOR表达的趋势。
　　3.右归饮、熟地黄对缺氧缺糖/复氧损伤的脑神经血管单元具有保护作用，其作用与增加EPO/EPOR的表达有关。
　　4.综合考量外源性EPO与补肾益精方药右归饮、熟地黄、制首乌均具有促进脑细胞生长增殖的作用，以及补肾益精方药右归饮、熟地黄还能显著促进脑组织细胞中EPO/EPOR表达，能初步证明促红细胞生成素（EPO)与“肾精”的相似性，即验证“EPO为肾精的生物学物质基础之一，EPO对脑细胞的保护和生长促进作用可能是‘肾精通于脑’的生物学作用机制之一”的假说。

著录项

作者
杨盛;
展开▼
作者单位

西南大学;

展开▼
授予单位西南大学;
学科中药学
授予学位硕士
导师姓名徐晓玉;
年度 2016
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类中药实验药理;神经原生理学;
关键词
补肾益精方药; 促红细胞生成素; 脑神经血管单元; 细胞生长; 血清药理学;

相似文献

中文文献
外文文献
专利

1. 补肾生血和补肾调经方药促血管生成作用实验研究 [J] . 张树成 ,吴志奎 ,王蕾 . 中医杂志 . 2000,第6期
2. 精浆调控子宫颈癌细胞血管生成因子分泌和促血管生成功能的作用及其机制研究 [J] . 王雅红 ,闫亚男 ,陈立立 . 实用肿瘤杂志 . 2015,第3期
3. Epo的促血管生成作用与子宫内膜异位症 [J] . 蔡国青 ,陈必良 . 中国妇幼健康研究 . 2003,第006期
4. rHuEPO体外促红细胞生成作用的观察 [J] . 石瑛 ,徐桢琦 ,王豫生 . 广东药学院学报 . 2001,第001期
5. 补肾益精方对生精障碍模型小鼠的促生精作用机制研究 [J] . 鲁维德 ,边应孝 . 四川中医 . 2004,第6期
6. 麝香保心丸对鸡胚绒毛尿囊膜及培养的血管内皮细胞的促血管生成作用——麝香保心丸的促血管生成作用(1) [C] . 汪姗姗 ,李勇 ,范维琥 . 第六次全国中西医结合心血管会学术会议 . 2002
7. EPOR在rh-EPO通过ERK信号通路促早产儿脑白质损伤模型鼠脑血管生成中的作用研究 [A] . 荆春平 . 2018

EPO促脑神经血管单元细胞生长及补肾益精方药促EPO生成作用研究

目录

摘要

著录项

相似文献

相关主题

期刊订阅