棉花查耳酮异构酶对类黄酮合成及棉花生长发育的影响

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陆地棉（Gossypium hirsutum）是世界上最重要的经济作物之一，是人类获取天然纤维的主要来源。类黄酮物质（Flavonoids）是一类广泛存在于植物体内的次生代谢产物，参与植物组织颜色的形成、花粉发育、植物激素的运输以及抗逆反应，在植物生长发育中具有非常重要的作用。查耳酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI,EC5.5.1.6)催化从查耳酮到黄烷酮的异构反应，是类黄酮生物合成途径中的关键酶。
　　为研究查耳酮异构酶对类黄酮合成及棉花生长发育的影响，本研究在生物信息学分析的基础上，克隆了查耳酮异构酶基因(GhCHI-A、GhCHI-D)，通过原核表达，分析了相应蛋白的催化酶活特性；并进一步通过在棉花（冀棉14，J14）中抑制和上调GhCHI-A基因的表达，研究了GhCHI在棉花类黄酮合成途径中及生长发育中的作用。
　　主要结果如下：
　　1.陆地棉中存在两个I型CHI蛋白
　　以拟南芥AtCHI基因为探针序列，在异源四倍体陆地棉（AADD）基因组中查找同源序列，共获得14个CHI同源蛋白。系统进化分析表明，这14个蛋白分列于3类CHI蛋白，其中有2个（GhA_13G0197和GhD_13G0211）属于I型CHI蛋白。这两个CHI蛋白与I型CHI具有高度的序列相似性，具有完整的底物结合和活性中心保守氨基酸残基，以及I型CHI蛋白的底物特异氨基酸残基。这两个基因在基因结构和序列上均分别与亚洲棉（AA）和雷蒙德氏棉（DD）的同源基因接近，分别命名为GhCHI-A和GhCHI-D。
　　通过qRT-RCR检测了这两个基因的表达水平，表明这两个基因在棉花各个组织中均有一定程度的表达，其中在叶片和胚珠的表达水平最高，但在开花后20天和25天的纤维中几乎没有表达；进一步分析表明，在生长阶段的棉花叶片中（Half expansion leaf,HL）的表达水平较高。
　　2.棉花GhCHI蛋白的酶活检测
　　为确定GhCHI蛋白的催化活性，构建了pET-28a-GhCHI-A/D蛋白表达载体，经IPTG诱导后，在大肠杆菌E.coli中诱导出了目的蛋白，纯化得到了相应的融合蛋白。实验表明GhCHI-A和 GhCHI-D重组蛋白均能在体外催化查耳酮异构为柚皮素，但均没有检测到催化柚皮素转化为查耳酮的活性；其最适反应pH均为8.0，最适反应温度均为37℃。在最适反应条件下，这两个蛋白的酶动力学参数稍有差别，其中GhCHI-A重组蛋白的Km=133.75nM，Vmax=0.0137nM/min；GhCHI-D重组蛋白的Km=211.10nM，Vmax=0.0226nM/min。这些结果表明GhCHI-A和GhCHI-D蛋白均是具有催化活性的I型CHI蛋白。
　　3.GhCHI-A影响棉花类黄酮的积累
　　为探究GhCHI在类黄酮合成途径中的功能，构建了GhCHI-A RNAi干扰载体和GhCHI-A超量表达载体，通过棉花遗传转化转入陆地棉（J14），经组织染色鉴定、自交，分别获得了纯合的转基因植株。GhCHI基因在GhCHI-A RNAi抑制植株中的表达水平显著降低，在GhCHI-A超量表达植株中的表达量均相对野生型提高了10倍以上；同时，酶活检测发现RNAi抑制棉花体内CHI酶活显著降低，而超量表达植株中CHI酶活略有升高。通过类黄酮含量检测发现，RNAi抑制植株的叶片、花瓣（开花当天和开花后1天）的花色素含量显著增加，幼嫩根尖区域的槲皮素含量、种子中原花色素（PAs）含量提高；而超量表达植株与对照植株相比，叶片、花瓣（0dpa）的花色素含量显著降低，根尖区域的槲皮素含量以及PAs含量没有明显变化。表明下调GhCHI-A基因的表达可以促进棉花的花色素、槲皮素等类黄酮的积累，而上调表达该基因却抑制了叶片中花色素的积累。
　　4.调控GhCHI-A基因的表达影响棉花的生长发育
　　为探索GhCHI对棉花生长发育的影响，比较了不同转基因材料和对照材料在植株生长、种子和纤维性状方面的差异。通过观察分析发现，RNAi抑制植株严重矮化，植株高度降低了15.5％，种子百粒重下降了20%，衣分提高了10%，纤维上半部平均长度降低了5.5%，且纤维量减少；而超量表达植株高度没有明显变化，种子百粒重下降了12%，种子偏黄，衣分下降了12%，纤维上半部平均长度提高了1.8%，纤维断裂比强度显著提高。由此可以看出，上调或下调表达GhCHI-A基因均会影响棉花植株的生长及种子的发育。

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作者
周见;
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作者单位

西南大学;

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授予单位西南大学;
学科生物化学与分子生物学
授予学位硕士
导师姓名肖月华;
年度 2016
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类优良品质的育种;
关键词
棉花; 类黄酮物; 查耳酮异构酶; 原核表达; 生长发育; 组织颜色形成;

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