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基于基因组编辑的家蚕丝腺遗传改良与应用研究

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进化是自然界最强大的力量之一，造就了自然界的千姿万态，也创造了具有精妙结构的大脑、狡猾善变的病毒、斑斓多彩的蝴蝶等一系列几近完美的生物学奇迹。蜘蛛和昆虫用来织造纤维的丝腺是众多生物学奇观中最为神秘和引人注目的器官之一。丝腺存在于很多昆虫和绝大部分蜘蛛体内，具有惊人的蛋白合成能力和储藏能力，尤以家蚕的丝腺为甚。经过长达数千年的人工驯化与选育，一头家蚕食下大约20克新鲜的桑叶便能生产0.5克丝蛋白，相当于自身干重的25％。这种奇妙的能力对于人类而言，其意义也许不仅仅是合成蚕丝。因为，在随着病原与致病机理的深入研究，越来越多的分子靶标得到了鉴定，疫苗、激素和蛋白源生物材料等生物医药蛋白需求与日俱增的今天，家蚕丝腺合成和储存蛋白的惊人能力，以及大规模生产成本低、对人畜安全、具有规模化生产的蚕丝产业基础等优势，使其有可能成为理想的生物反应器模型。
　　然而既成于进化之美，也败于进化之顽固。进化的神奇力量造就了可以称之为生物学奇观的丝腺，给渴望利用自然者赐予了这一设计复杂而精妙的器官，也给开发丝腺生物反应器的人们以无限的希望;然而，也是进化的天衣无缝阻碍了“拓荒者们”前进的脚步。自2003年首次在丝腺中表达人胶原蛋白以来的十余年时间里，EGFP融合蛋白、表皮生长、干扰素、血清白蛋白、单克隆抗体等具有重要市场价值的蛋白也相继在家蚕丝腺中得到表达，但是由于外源蛋白在丝腺中的表达量极低、极难纯化或纯化成本过高，迄今还没有一个生产于家蚕丝腺的的蛋白能够应用到市场生产中。一边是家蚕丝腺惊人的蛋白合成和储存能力作为新一代生物反应器的诱人前景，另一边是实际开发中低得几乎让人绝望的外源蛋白表达量。经过广泛的文献调查和实验检验，我们发现，家蚕丝腺生物反应器的广阔前景和现实之间依然存在着两个巨大的鸿沟:第一、在长期进化和人工选择的过程中，家蚕丝腺已成为一个异常特化的器官，其细胞内的基因组结构和一切新陈代谢都是为丝蛋白的分泌、合成和运输服务，导致外源蛋白的表达量极低;第二、由于蚕丝蛋白具有自组装的特性，其在丝腺和茧层中的大量存在使得本来含量就不高的外源蛋白的纯化变得极其困难。鉴于上述分析，我们提出了降低内源性家蚕丝蛋白的含量来提高外源蛋白表达量的策略。为实现这一策略，首先通过转基因干涉手段下调了BmSer1基因的表达并利用红色荧光蛋白DsRed作为标记蛋白证实了BmSer1的下调能够提高外源蛋白在中部丝腺的表达量。在此基础上我们进一步提出了对丝蛋白主要编码基因进行敲除，创造能在高量表达外源蛋白的同时消除丝蛋白对外源蛋白纯化影响的“空丝腺”，构建超级生物反应器的设想。为此，我们建立了高效、稳定、简单易行的基于ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9的家蚕基因组编辑技术体系，并利用该体系对丝蛋白的最主要成分BmFib-H蛋白的编码基因进行了敲除，获得了分别具有显性和隐性遗传特性的两类突变品系。然后，利用EGFP融合蛋白和自主设计的人工蚕丝蛋白为模式，证实了BmFib-H基因的隐性突变品系可以作为重组蛋白和生物材料的理想生物反应器模型，外源蛋白的含量高达茧重的50％。最后，我们还获得了BmFib-L基因的突变品系，并探讨了BmP25、BmSer1、BmPSer3等其他丝蛋白基因的快速敲除，为“空丝腺”生物反应器的进一步改进和优化奠定了基础。论文取得的主要结果和结论如下:
　　1.提出并证实了下调BmSer1能够提高外源蛋白在中部丝腺的表达量。
　　鉴于外源蛋白在家蚕丝腺中的表达量低和茧壳中外源蛋白的纯化难对家蚕丝腺生物反应器的开发和利用的极大限制，前人的大量研究证实筛选启动子、使用增强子、优化密码子、添加UTR、更换终止序列、筛选插入位点、利用绝缘子、选择不同品种等常见的提高外源蛋白的方法都难以解决外源蛋白表达量低和难纯化的问题。我们提出了一种全新的提高外源蛋白在家蚕丝腺中表达量的策略;构建了在中部丝腺特异下调BmSer1基因的转基因干涉载体，制备的转基因家蚕中BmSer1基因的表达量在mRNA水平下调了50％;制备了在中部丝腺的中后部特异表达、特异分布于外层茧壳的红色荧光蛋白DsRed，发现了外源蛋白的表达量达到一定程度之后会影响家蚕的吐丝结茧过程;将两个转基因品系进行杂交发现BmSer1基因下调之后，DsRed蛋白的表达量在mRNA和蛋白质水平均有所提高。这一研究结果，首先证实了通过降低内源蛋白提高外源蛋白表达量的策略是切实可行的;其次，证实了外源蛋白高量表达对吐丝结茧过程的影响，为丝腺生物反应器的开发与利用提出了新的问题;第三，为进一步建立家蚕基因组编辑技术、敲除丝蛋白编码基因以进一步提高外源蛋白表达量的设想奠定了理论基础。
　　2.建立了高效、稳定、简单易行的家蚕基因组编辑技术体系。
　　近年来，ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等基因组编辑技术的出现及近年来迅猛的发展已经在生命科学基础理论研究、经济物种的遗传改造，以及人类疾病的预防与治疗等领域掀起了一场如火如荼的革命。本论文均是在这些技术发明后第一时间建立了属于家蚕自己的基因组编辑系统，经历了从不可能到可能、从可能到高效，再从高效到简单的一个过程，期间取得了一系列有趣的研究成果:(1)建立了构建TALEN载体的组装体系，为在家蚕中利用TALEN进行基因组编辑奠定了基础;(2)构建了在细胞中筛选和验证TALEN活性的检测体系，为在个体水平进行高效的基因组编辑奠定了基础;(3)在家蚕中首次证实了TALEN可以用于体细胞和可遗传的基因组编辑，这一尝试的成功改变了几十年以来家蚕中缺乏有效的基因敲除技术体系的局面;(4)利用家蚕作为研究模式，首次证实了TALEN可以介导长片段的基因组结构变异，其片段的长度可以达到8.9mb，相当于整个染色体的三分之一;(5)利用家蚕作为研究模式，首次证明了TALEN介导的长片段基因组删除可以遗传，并获得具有表型的可遗传个体;(6)在家蚕中首次建立了基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术体系，并通过载体优化使其效率得到了很大的提高，这一系统的建立使得家蚕基因组编辑变得更加简单和高效;(7)通过结合TALEN和ssODN的方法实现了精确的基因组结构变异，为家蚕乃至其他物种的基因组结构变异研究提供了重要参考;(8)证实了CRISPR/Cas9能在家蚕细胞中介导高效的定点基因突变和靶向基因组结构变异;(9)证实了CRISPR/Cas9能介导可遗传的基因组编辑，并以BmKu70基因为例，探索了如何利用CRISPR/Cas9技术在家蚕中获得未知表型的基因的突变体;(10)通过分析TALEN和CRISPR/Cas9介导的基因组结构变异的差异，证明了长染色体片段重复发生的机理。这一完善、高效的基因组编辑技术体系不但为本论文提出的敲除丝蛋白编码基因、制备“空丝腺”生物反应器的设想提供了技术支撑，也为推动家蚕功能基因组研究、建立新一代家蚕品种选育技术提供了理论和技术参考。
　　3.制备了BmFib-H基因的突变品系并通过其表型和遗传分析发现了BmFib-H基因的新功能。
　　Bmfib-H基因是家蚕中研究最早、最为重要和最知名的基因，是维系蚕丝产业延绵千年的主要分子生物学基础。由于受制于家蚕遗传操作技术的匮乏，从最早分离得到其mRNA至今的40余年时间内，人们只知道其重要性，但是其具体的生理功能和分子机理没有得到解析。我们设计了靶向Bmfib-H基因第二外显子非重复区域的两对具有高活性的ZFN。并通过显微注射在大造和N4两个品种中获得了Bmfib-H基因的突变体，对其进行基因型、表型和遗传规律的分析发现:(1)Bmfib-H突变体含有两种不同类型的基因型，分别造成移码突变和单个氨基酸缺失;(2)Bmfib-H能产生两种分别具有显性和隐性遗传规律的突变体，其中显性遗传突变的基因型为单个氨基酸缺失，隐性遗传突变的基因型为移码突变;(3)进一步分析发现显性遗传突变体的分子机理不同于已有的显性突变机理，为错误折叠的丝蛋白对丝腺细胞的生长发育造成的影响，是一种全新的显性突变机制;(4) Bmfib-H突变体后部丝腺的细胞数量与野生型家蚕一致，但是单个细胞小于野生型，以至于后部丝腺比野生型家蚕短小，但中部丝腺和前部丝腺没有明显的差异;(5)Bmfib-H突变体由于没有Bmfib-H蛋白合成，因此后部丝腺和中部丝腺都表现为中空的形态;(6) Bmfib-H突变体只能合成和分泌丝胶蛋白和其他小分子的丝素蛋白，因此形成一个薄而脆的“丝胶茧”，其茧重、茧层厚度和茧丝直径都要显著低于野生型;(7) Bmfib-H突变体的蛹比野生型大而重，暗示敲除个体中蚕茧与蚕蛹之间存在能量相互转化机制;(8) Bmfib-H突变体后部丝腺的生长发育特征为家蚕丝腺细胞生长动力和内在机制的研究提供了新的遗传素材;(9) Bmfib-H突变体茧壳中也检测到了BmFib-L和BmP25蛋白的存在，这一结果为丝蛋白合成、分泌和运输的机制提供了新的参考。上述的BmFib-H基因敲除以后丝腺变小、变中空，茧层薄而脆，茧丝只含丝胶蛋白等结果为“BmFib-H蛋白是茧丝的主要成分，是决定蚕丝力学性能的关键因素”这一传统的观点提供了新的证据;关于遗传特性、丝蛹平衡、蛋白分泌的诸多探索也为BmFib-H基因功能的研究提出了新的课题;更为重要的是，BmFib-H基因敲除获得的“空丝腺”品系可能成为高效表达外源蛋白的理想受体。
　　4.在“空丝腺”生物反应器中成功表达外源蛋白，表达量达到50％。
　　为了验证BmFib-H基因突变体是否能突破困扰丝腺生物反应器开发和利用的两大瓶颈，我们利用在后部丝腺特异表达EGFP融合蛋白的转基因载体，制备了以BmFib-H基因的纯和突变体、杂合突变体和野生型N4为遗传背景的转基因家蚕。结果显示在三个转基因系的茧壳中均能检测到荧光信号，表明EGFP融合蛋白能够成功的在Fib-H-I1(N4)的丝腺中表达，而且能够分泌和运输到茧壳中。暗示虽然Fib-H-I1(N4)的后部丝腺要小于野生型家蚕，但是其高量合成蛋白的能力并没有受到影响。茧层蛋白SDS-PAGE和western blot分析显示EGFP融合蛋白在BmFib-H基因的纯和突变体、杂合突变体茧壳中的含量分别达到茧壳总重的50％和52％。这一结果表明，通过敲除BmFib-H基因制备的“空丝腺”可以作为理想的生物反应器模型。对比已有文献的报道，本研究建立起来的基于Fib-H-I1突变体的丝腺生物反应器是目前已知的外源蛋白表达量最高的生物反应器。除了外源蛋白表达量高以外，“空丝腺”生物反应器还具有以下优势:由于丝腺腔和茧层中蛋白组分简单，尤其是在BmFib-H基因敲除以后便只剩下一些可溶的丝胶蛋白和小分子的其他丝素蛋白，外源蛋白的纯化也会变得非常的简单。
　　5.利用“空丝腺”合成了人工设计的蚕丝纤维。
　　为了进一步验证BmFib-H基因突变体能否作为生物材料的反应器，我们以家蚕丝蛋白的氨基酸序列为基础，设计了一个包含BmFib-H蛋白部分结构域和EGFP蛋白的人工丝蛋白，并构建以BmFib-H基因启动子驱动其在后部丝腺特异表达的转基因载体，用BmFib-H基因突变体制备了转基因家蚕。荧光检测结果显示，后部丝腺、中部丝腺、前部丝腺和茧壳中均能检测到明显的荧光信号，茧壳的SDS-PAGE和western blot分析的结果也显示人工丝蛋白大量存在于茧壳中，暗示人工丝蛋白能够成功的在后部丝腺细胞中合成并分泌到茧壳中。转基因茧层中丝纤维的直径、茧层重与茧层率都要大于非转基因BmFib-H突变体。SEM结果显示，人工丝蛋白在茧壳中能形成明显的丝纤维结构，力学性能检测进一步显示这些丝纤维具有显著强于非转基因BmFib-H突变体的力学性能。这一结果不但表明“空丝腺”可以作为蛋白源生物材料的生物反应器，也为蚕丝纤维的人为改良和重新设计提供了示范和参考。
　　6.获得了BmFib-L基因的突变品系，并探讨了BmP25，BmSer1，BmPSer3等其他丝蛋白基因的快速敲除方法。
　　为了获得外源蛋白表达量更高、更易纯化的“空丝腺”生物反应器模型，我们又探索了其他丝蛋白编码基因的敲除:(1)首先利用TALEN实现BmFib-L基因的敲除，获得了相应的突变体;(2)考虑到丝蛋白编码基因较多，要获得所有主要丝蛋白编码基因同时敲除的个体需要花费太长的时间，我们探索并建立了多基因同时敲除的方法，在BmNs细胞中实现了6个基因10个不同位点的同时基因组编辑;(3)在细胞和胚胎水平证实了一次性同时敲除BmP25，BmSer1和BmPSer3基因的可行性。一次性多基因敲除体系的建立，不但为主要丝蛋白编码基因的同时敲除奠定了理论和技术基础，也极大地丰富和完善了家蚕基因组编辑技术平台。
　　综上所述，本论文提出的假设、采用的方法以及获得的结果，无论是在蚕丝合成机理研究方面，还是在生物反应器研究和开发方面，以我们有限的知识来讲，都是鲜有报告的。通过抑制内源丝蛋白基因的表达、甚至是敲除主要的内源丝蛋白基因来提高外源蛋白表达量，这一策略的提出和证实不但有效解决了困扰丝腺生物反应器研究与开发的两大瓶颈，为真正实现利用丝腺生物反应器规模化和市场化的生产扫清了障碍，也为其他生物反应器的开发提供了重要的思路和参考。基因组编辑技术是现代遗传学发展历程中的重大革命性技术，我们以敲除家蚕丝蛋白基因为契机，在家蚕中建立了稳定高效而简单易行的基因组编辑技术体系，并以家蚕作为模式生物探讨了基因组编辑研究领域最前沿、最富有挑战性的课题。基因组编辑对于家蚕研究领域而言，有着太多太深长的意味，本论文建立起来的基因组编辑技术，也算是实现了蚕学研究领域追逐多年的夙求，更是为现代家蚕功能基因组研究提供了更多更精彩的可能性。除了理论上的创新和技术上的突破，我们更期待本论文获得的“空丝腺”能成为丝腺生物反应器的新起点与新希望，成为丝腺生物反应器从梦想到现实的重要转折点。

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