连接蛋白Cx43及由其形成的缝隙连接在大鼠脑缺血后处理中的保护作用及可能机制

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目的：
　　1.观察激酶调控下的缝隙连接功能（gap junction, GJ）在缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。
　　2.初步探讨IP3、Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2在GJ介导的扩大损伤中的作用。
　　方法:
　　采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型；Longa’s法评价大鼠神经功能损伤；TTC染色法检测大鼠脑梗死体积变化；HE染色法检测大鼠脑组织形态学变化；Western Blotting法检测脑组织中缝隙连接蛋白Cx43、Cx32，缝隙连接功能调控激酶PKC、ERK1/2、p-PKC和凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3的表达；RT-PCR法检测脑组织中 Cx43mRNA的变化；Elisa法检测脑组织中磷酸肌醇（inositol trisphosphate, IP3）的变化。
　　结果:
　　1.神经功能评分结果显示，假手术（Sham）组无神经功能损伤；与Sham相比，缺血再灌注(ischmia/reperfusion, I/R)组神经功能评分显著增高；与I/R组相比，缺血后处理（ishemic postconditioning, IPO）组神经功能损伤显著降低；与IPO组相比，甘珀酸(Carbenoxolone, CBX)干预缺血后处理（IPO+CBX）组神经功能损伤进一步降低。结果表明，缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经功能具有保护作用，抑制缝隙连接后可增强缺血后处理的神经功能保护作用。
　　2. TTC染色结果显示，Sham组未见梗死灶；与Sham组相比，I/R组脑梗死体积增大；与I/R组相比，IPO组脑梗死体积显著减小；与IPO组相比，IPO+CBX组脑梗死体积进一步减小。结果表明，IPO可缩小大鼠脑缺血再灌注损伤的脑梗死体积，抑制缝隙连接后可使脑梗死体积进一步减少。
　　3. HE染色结果显示，Sham组组织切片结构清晰完整、细胞排列整齐，胞核居中，核膜核仁清楚；与Sham组相比，I/R组脑组织细胞排列紊乱、胞核固缩等组织形态学改变显著；与 I/R组相比，IPO组细胞排列紊乱及胞核固缩等病理学改变显著改善；与IPO组相比，IPO+CBX组脑组织病理学改变进一步改善。以上结果表明，缺血后处理对缺血再灌注损伤具有保护作用，抑制缝隙连接可增加缺血后处理对缺血再灌注损伤的保护作用。
　　4. Western blotting检测缝隙连接蛋白结果显示，与Sham组相比，I/R组Cx43蛋白表达显著增加；与 I/R组相比，IPO组Cx43蛋白表达显著降低；与 IPO组相比， IPO+CBX组Cx43蛋白表达进一步降低。同时，缝隙连接蛋白Cx32在各处理组中表达无显著性差异（P>0.05）；缝隙连接蛋白Cx26在各处理组中表达较少。结果提示， IPO对I/R损伤的保护作用可能与Cx43蛋白表达的抑制有关。
　　5. RT-PCR法检测Cx43mRNA结果显示，各处理组中的Cx43mRNA的表达无显著性差异（P>0.05）。结果提示，IPO抑制缝隙连接蛋白Cx43的表达可能通过转录后调控而实现的。
　　6. Western bloting检测缝隙连接功能的激酶调控蛋白表达结果显示，与Sham组相比，I/R组PKC蛋白表达显著降低；与I/R组相比，IPO组PKC蛋白表达显著增加；与IPO组相比，IPO+CBX组PKC蛋白表达进一步增加。而p-PKC蛋白的检测结果显示，与Sham组相比，I/R组和I/R+CBX组p-PKC表达显著增加；与I/R组相比，IPO组较I/R组p-PKC蛋白表达显著降低；而IPO+CBX组较IPO组p-PKC蛋白表达无显著性差异(P>0.05)。且Sham、IPO、IPO+CBX组p-PKC蛋白表达均较少。同时，缝隙连接功能调控蛋白ERK1/2在各处理组中的表达无显著性差异（P>0.05）。结果提示，PKC蛋白可能参与了IPO对I/R损伤保护作用中GJ功能的调控。
　　7. Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达结果显示，与 Sham组相比，I/R组Bax/Bcl-2表达显著增加；与I/R组相比，IPO组Bax/Bcl-2表达显著降低；与IPO组相比，IPO+CBX组Bax/Bcl-2表达进一步降低。同时，Caspase-9、Caspase-3表达与 Bax/Bcl-2有类似的变化。结果提示，IPO抑制 GJ功能而降低 I/R损伤可能与Bax/Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3与关。
　　8. Elisa检测IP3结果显示，与Sham组相比，I/R组IP3表达显著增加；与I/R相比， IPO组IP3表达显著降低；与IPO相比，IPO+CBX组IP3表达进一步降低。结果提示，IPO抑制GJ功能而降低I/R损伤可能与IP3有关。
　　结论：
　　1. IPO可通PKC抑制Cx43缝隙连接功能而减轻I/R损伤。
　　2. IPO抑制GJ功能而降低I/R损伤可能与Bax/Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、IP3降低有关。

著录项

作者
焦浩;
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作者单位

蚌埠医学院;

展开▼
授予单位蚌埠医学院;
学科药理学
授予学位硕士
导师姓名童旭辉,董淑英,葛敏;
年度 2014
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类短暂性脑缺血;
关键词
激酶调控; 缝隙连接功能; 脑缺血; 再灌注损伤; 保护作用; 动物模型;

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