体外检测遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的方法及检测用试剂盒

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体是涉及遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的检测方法。本发明还涉及根据该方法在体外检测遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的试剂盒。

背景技术

耳聋是临床上最常见的遗传病之一，是导致言语交流障碍最常见的疾病。据各国统计，有1/2000～1/1000的儿童出生时为极重度耳聋；同时，一半以上的儿童期耳聋是由于遗传因素造成的(Marazita ML，等，Am J Med Genet.1993，46：486-491；Kalatzis V等，Hum Mol Genet.1998，7：1589-1597；Morton CC，Hum Mol Genet.2002，11：1229-1240)。遗传性耳聋中有70％为非综合征型耳聋(nonsyndromic hearing impairment，NSHI)，其余30％为综合征型耳聋(syndromic hearing impairment，SHI)。大约75％～85％的NSHI表现为常染色体隐性遗传模式，15％～24％为常染色体显性遗传模式，其余1％～2％为X连锁遗传模式。GJB2基因突变与遗传性非综合征型耳聋密切相关，包括常染色体显性遗传性聋DFNA3和常染色体隐性遗传性聋DFNB1，是遗传性耳聋最常见的原因(Kelley PM等，Am J Hum Genet.1998，62：792-799)。此外，GJB2基因还与部分综合征型耳聋有关(Richard G等，Hum Genet，1998，103：393-399)。GJB2基因编码的缝隙连接蛋白26属于缝隙连接蛋白基因家族，与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道，这些通道在信息传导和物质交换中起重要作用，是完成电解质、第二信使和代谢产物的细胞间转换的重要通道。当毛细胞受到外界刺激后，钾离子经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液，缝隙连接蛋白通道在此过程中具有调控作用，缝隙连接蛋白26在人类的耳蜗毛细胞中高表达，因此GJB2基因突变与耳聋密切相关。

GJB2基因1993年被克隆，定位于13q11-12，DNA全长6710bp(ENSG00000165474)，被一个内含子分成一个非编码的上游外显子和一个较大的含有完整编码序列的第二外显子。编码区为681bp，存在于第二外显子。GJB2基因的筛查方法多种多样，包括限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、限制酶切指纹—单链构象多态性分析(REF-SSCP)、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、变性高效液相色谱分析(dHPLC)及直接测序等。直接测序(direct sequencing，DS)是将PCR扩增产物进行测序反应后纯化、变性，在测序仪上进行测序，利用软件将测序结果与标准序列进行比对寻找突变，是突变鉴定的金标准。

中国聋人群体中21.01％耳聋与GJB2基因有关，其中14.96％携带GJB2编码区双等位基因突变，可以明确为GJB2基因突变致聋，另外6.05％携带GJB2编码区单等位基因突变，耳聋与GJB2基因突变有关，但还待寻找另外一个等位基因上的突变以确定耳聋病因(于飞等，中华医学杂志，2007，87：2814-2819)。

目前，对GJB2基因突变的检测仅限于对编码区即外显子2的序列测定或针对单个常见突变位点的限制性内切酶分析，此种检测分析方法虽然可以检测出GJB2基因是否突变，但仅仅限于对GJB2基因编码区即外显子2的序列测定或针对单个常见突变位点的限制性内切酶分析，无法全面准确分析耳聋与GJB2基因突变之间的关系，也因此无法准确判定是否是遗传性耳聋。

发明内容

本发明的目的是针对目前检测遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的方法所存在的缺点，提供一种准确、可靠、稳定的覆盖GJB2基因基础启动区、外显子1及剪切区域和外显子2及剪切区域的突变检测方法。

本发明的另一个目的是提供检测遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的试剂盒。

研究发现不但GJB2编码区(外显子2)基因突变是致聋原因，GJB2基因外显子1与内含子1的剪切区突变IVS1+1G>A也是致聋原因之一，尤其在携带GJB2编码区即外显子2单等位基因突变的个体，进行GJB2外显子1的筛查，更有利于明确耳聋病因。此外，GJB2基因外显子1上游基础启动区的突变也参与该基因致聋，因此，对GJB2基因基础启动区、外显子1及剪切区域和外显子2及剪切区域进行检测是诊断遗传性耳聋又一有力手段。

本发明即提供一种体外检测遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的方法，通过进行聚合酶链反应，对GJB2基因基础启动区、外显子1、外显子2及剪切区域进行完整扩增，然后进行DNA序列测定，检测GJB2基因突变的存在。

本发明的方法，在进行聚合酶链反应时，所设计的引物为：扩增基础启动区、外显子1及其剪切区域的正向引物F1是GJB2基因的核苷酸414-445，其序列为序列表中的SEQ IDNO：1；扩增基础启动区、外显子1及其剪切区域的反向引物R1是GJB2基因的核苷酸895-921，其序列为序列表中的SEQ ID NO：2；扩增外显子2及其剪切区域的正向引物F2是GJB2基因的核苷酸3860-3879，其序列为序列表中的SEQ ID NO：3；扩增外显子2及其剪切区域的反向引物R2是GJB2基因的核苷酸4800-4819，其序列为序列表中的SEQ ID NO：4。

本发明中的引物设计可以使用Genetool Lite程序(美国Biotools公司提供的软件)协助设计两对引物F1、R1和F2、R2。F1、R1扩增片段覆盖GJB2基因基础启动区、外显子1及其剪切区域，F2、R2扩增片段覆盖GJB2基因外显子2及其剪切区域。将得到的PCR扩增产物分别进行测序反应及其后的纯化、变性，在测序仪上进行测序，利用软件将测序结果与标准序列进行比对，检测GJB2基因突变的存在。

本发明还提供一种根据上述方法进行体外检测GJB2基因突变的试剂盒或类似产品，其含有：

(1)PCR扩增反应试剂：包括dNTP、2×PCR缓冲液(扩增外显子1专用)、10×PCR缓冲液(扩增外显子2专用)、Mg++、三蒸水、Taq酶1(扩增外显子1专用)、Taq酶2(扩增外显子2专用)；

(2)等比例混合的权利要求2所述的扩增GJB2基因基础启动区、外显子1及其剪切区域的正向引物F1和扩增GJB2基因基础启动区、外显子1及其剪切区域的反向引物R1，等比例混合的权利要求2所述的扩增GJB2基因外显子2及其剪切区域的正向引物F2和扩增外显子2及其剪切区域的反向引物R2。

本发明的试剂盒或类似产品，其中还包含提取血样DNA的试剂；所述的提取血样DNA的试剂可以为提取足根血DNA的溶液I，其主要成分为Chelex；或者为外周血DNA提取试剂盒。

本发明的试剂盒或类似产品，其中还包含使用说明书。：

在本发明中，GJB2基因基础启动区、外显子1及其剪切区域富含GC碱基，GC比例达到76.78％，PCR扩增困难，针对这一特点我们采用专门扩增高GC含量DNA序列的PCR缓冲液和Taq酶，并针对该序列特点制定专门的PCR反应条件以确保得到产量高、特异性强的PCR产物进行序列测定。F1R1扩增片段长508bp。F2R2扩增片段长960bp。通过对该两片段进行序列测定，可以覆盖迄今为止发现的全部GJB2基因致病突变。

本发明人还根据本发明中设计的引物序列，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)获得引物，并与提取血样DNA的试剂、PCR扩增反应试剂，包括dNTP、2×PCR缓冲液(扩增外显子1专用)、10×PCR缓冲液(扩增外显子2专用)、Mg++、三蒸水、Taq酶1(扩增外显子1专用)、Taq酶2(扩增外显子2专用)，以及使用说明书组合起来，提供了用于体外检测遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的试剂盒，其主要功能在于将所有试剂集成在一个小盒内，使得DNA提取、核酸片段扩增可以在试剂盒提供的试剂的基础上顺序完成。根据取血方式或被测样本形式的不同，本发明的试剂盒有三种类型可供选用，三种类型中除了提取血样DNA的试剂外，其余组分都相同。一型试剂盒提取血样DNA的试剂为用作DNA裂解液的溶液1，其主要成分是Chelex(ABI公司产品)，适用于足跟血血片被测样本；二型试剂盒提取血样DNA的试剂为外周血DNA试剂盒(选用市售产品配套使用)，适用于外周血被测样本；三型试剂盒不含提取血样DNA的试剂，适用于直接提供DNA的被测样本。

用本发明的方法检测遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的技术与现有技术检测GJB2基因编码区即外显子2技术相比有以下优点：本发明的方法能完整覆盖GJB2基因基础启动区、外显子1和外显子2及剪切区域的所有突变，能提高GJB2基因突变的检出率和GJB2基因相关性遗传性耳聋的诊断率，较单独进行GJB2编码区测序更全面、可靠，有利于遗传性耳聋的诊断。

附图说明

图1：实施例1中的家系系谱图。

图2：2-24泳道为耳聋患者DNA样本F1R1引物扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，扩增片段508bp，其中包含GJB2基因基础启动区、外显子1及其剪切区域；1泳道为空白对照；M为DNA分子量标记Marker。

图3：1-23泳道为耳聋患者DNA样本F2R2引物扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，扩增片段960bp，其中包含GJB2基因编码区即外显子2及其剪切区域；24泳道为空白对照；M为DNA分子量标记Marker。

具体实施方式

实施例1  常染色体隐性遗传家系遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的检测

1.检测样本

选择以常染色体隐性遗传为传递特征的耳聋家系1个，总人数为27人，其中耳聋患者共3人。受检者中，耳聋患者为2人，从被检个体提取外周全血DNA(袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33(2)：67-70；李为民等，临床耳鼻咽喉科杂志，2001，15(增刊)：53-58)，作为检测样本。家系的系谱图见图1。

先证者，男，15岁，汉族，足月顺产。1岁时发现耳聋，用药史不详。查体：全身情况正常，鼓膜完整，颞骨CT检查排除内耳畸形。家庭情况：父亲有噪音接触史；姐姐18岁，听力稍差。

2.引物设计

根据己公开的GJB2基因序列(ENSG00000165474)使用GenetoolLite程序协助设计引物。扩增基础启动区、外显子1及其剪切区域的正向引物F1是GJB2基因的核苷酸414-445，其序列为序列表中的SEQ ID NO：1；扩增基础启动区、外显子1及其剪切区域的反向引物R1是GJB2基因的核苷酸895-921，其序列为序列表中的SEQ ID NO：2；扩增外显子2及其剪切区域的正向引物F2是GJB2基因的核苷酸3860-3879，其序列为序列表中的SEQ ID NO：3；扩增外显子2及其剪切区域的反向引物R2是GJB2基因的核苷酸4800-4819，其序列为序列表中的SEQ ID NO：4。

3.PCR扩增反应

根据上述设计的引物序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)得到正向引物F1和反向引物R1，并以上述提取的被测样本周边血DNA为模板，进行PCR扩增反应。

反应体系：

DNA(20ng/μl)          3μl

1F(5pmol/μl)          1μl

1R(5pmol/μl)          1μl

2×Buffer             15μl

10×dNTP              4.7μl

Mg⁺⁺                  终浓度1.5mmol/L

Taq1                  1.5U

加三蒸水至30μl体积。

反应条件：

94℃预变性5分钟后，接着94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后在72℃下再延伸7分钟。

用1％琼脂糖凝胶电泳检查产物。F1、R1进行PCR扩增后能够获得明亮清晰的略大于500bp的条带(见图2)。

根据上述设计的引物序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)得到正向引物F2和反向引物R2，并以上述提取的被测样本周边血DNA为模板，进行PCR扩增反应：

反应体系：

DNA(20ng/μl)          3μl

2F(5pmol/μl)                2.5μl

2R(5pmol/μl)                2.5μl

10×Buffer                  5μl

10×dNTP                    5μl

Mg⁺⁺                        终浓度1.5mmol/L

Taq2                        5U

加三蒸水至50μl体积。

反应条件：

94℃预变性5分钟后，接着94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行32个循环，最后在72℃下再延伸7分钟。

用1％琼脂糖凝胶电泳检查产物。F2、R2进行PCR扩增后能够获得明亮清晰的略大于960bp条带(见图3)。

4.PCR产物的纯化及序列测定

(1)PCR产物纯化：

1)在被测样本的PCR扩增产物中加入0.1倍体积3MNaAc(PH＝5.2)；

2)加入2.5倍体积无水乙醇；

3)4℃放置20分钟；

4)4℃下5700rpm/min离心25min，弃上清；

5)加入75％乙醇200μl，4℃下5700rpm/min离心25min，弃上清；

6)置于PCR仪上95℃烘干1分钟(开盖)，加入20μl双蒸水溶解。

(2)纯化后PCR产物定量：加入5μlPCR产物和1μlBuffer混合物，经凝胶电泳测定DNA含量后，将其稀释成5ng/μl。

(3)测序PCR反应：纯化并稀释后的PCR扩增产物按下述条件扩增：

反应体系：

纯化后PCR产物(5ng/μl)            1μl

1F(5pmol/μl)或1R(5pmol/μl)       1.5μl

5×Buffer                       1.5μl

2.5×Bigdye                     0.5μl

加三蒸水至10μl体积。

反应条件：

96℃预变性1分钟后，接着96℃变性10秒，50℃退火5秒，60℃延伸4分钟，共进行25个循环。

(4)测序反应PCR产物纯化：

1)在10μl的测序反应PCR产物中加入1μl125mM EDTA到管底；

2)加入1μl3MNaAc(PH＝5.2)到管底；

3)加入25μl无水乙醇；

4)4℃放置20分钟；

5)4℃下5700rpm/min离心25min，弃上清；

6)加入75％乙醇200μl，反复混匀，4℃下5700rpm/min离心20min，弃上清；

7)重复步骤(6)；

8)置于PCR仪上95℃烘干1分钟(开盖)，加入甲酰胺13ul溶解；

9)置于PCR仪95℃变性5min，后迅速置于冰上5min后上样，进行测序。

(5)测序结果使用Genetool Lite软件包与来自NCBI网站的人类GJB2基因标准序列(ENSG00000165474)进行比对，发现可疑的突变位点后用Chromas软件读取测序结果的峰图文件，进行确认或排除。

注：在没有测序仪的单位可以直接将PCR扩增产物送至测序公司进行测序，可省略整个第4步即PCR产物的纯化及序列测定。

5.结果

在对F2R2扩增的PCR产物的测序中发现，患者为35delG/299-300delAT复合突变，进一步对该例患者的家属进行GJB2基因检测(其姐及其他8名家属因在外地，未能参加检测)，发现35delG来自父系(其中5例家属为35delG携带者)，299-300delAT来自母系(其中2例家属为299-300delAT携带者)。该先证者耳聋的病因可以明确为由GJB2基因突变导致的常染色体隐性遗传性耳聋。

实施例2  不明原因感音神经性耳聋散发病例遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的检测

1.检测样本

选择不明原因感音神经性耳聋散发患者50人，从被检个体提取外周全血DNA(袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33(2)：67-70；李为民等，临床耳鼻咽喉科杂志，2001，15(增刊)：53-58)，作为检测样本。

2.引物设计  3.PCR扩增反应  4.PCR产物的纯化及序列测定同实施例1。

5.结果：见表1。

表1 实施例2GJB2基因检测结果

实施例3  遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的一型试剂盒及其应用

1.适用于足跟血片的一型试剂盒(100人份)包含以下组分：

(1)溶液I(主要成份为5％Chelex)25ml；

(2)PCR扩增反应试剂，包括dNTP、2×PCR缓冲液(扩增外显子1专用)、10×PCR缓冲液(扩增外显子2专用)、Mg++、三蒸水、Taq酶1(扩增外显子1专用)、Taq酶2(扩增外显子2专用)；

(3)等比例混合的权利要求2所述的扩增GJB2基因基础启动区、外显子1及其剪切区域的正向引物F1和扩增GJB2基因基础启动区、外显子1及其剪切区域的反向引物R1，等比例混合的扩增外显子2及其剪切区域的正向引物F2和扩增外显子2及其剪切区域的反向引物R2；

(4)使用说明书。

2.检测对象

选择不明原因感音神经性耳聋散发患者25人为受检对象(与实施例2检测对象不重叠)。3.检测方法及结果

按照本试剂盒的使用说明书，用溶液I(主要成份为5％Chelex)提取受检者的足根血血片DNA，反应体系和反应条件同实施例1。检测结果见表2。

表2实施例3GJB2基因检测结果

实施例4  遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2突变的二型试剂盒及其应用

选择不明原因感音神经性耳聋散发患者25人为受检对象(与实施例2、3检测对象不重叠)。除了受检样本为周边血，以及试剂盒中的血样DNA提取剂为市售的周边血DNA提取试剂盒，并用该试剂盒提取周边血DNA以外，试剂盒中其他组分和检测方法与实施例3相同。检测结果见表3。

表3 实施例4GJB2基因检测结果

综上所述，本发明用于体外检测遗传性耳聋相关缝隙连接蛋白26基因GJB2的突变，具有良好的准确性。

注：本说明书中涉及的％除有说明外，均指得是重量百分比。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

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