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两种小分子靶标药物在癌症治疗中的作用机制探究

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第一部分：FGF19基因在肝癌耐药过程中的作用机制 肝癌是一种死亡率高，恶性程度强的肿瘤。在中国肝癌病人的死亡率约占全世界的一半，如此严峻的形势给中国的经济发展带来了沉重的负担。目前，索拉非尼作为肝癌晚期的临床治疗药物具有较理想的效果，但是随着用药时间的延长，病人会出现索拉非尼耐药问题进一步导致肝癌病人的不良预后，这一问题严重阻碍索拉非尼在临床中的应用。因此，研究索拉非尼的耐药机制对提高其抗肿瘤效果具有重要意义。 人成纤维细胞生长因子19 （fibroblast growth factor 19，FGF19）是FGF家族的成员之一，其位于染色体 11q13.1 上的基因，其编码的蛋白有 216 个氨基酸。FGF19 的高表达与多种肿瘤的发生与发展密切相关，例如肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌和胆管癌等。目前研究已表明 FGF19的表达水平与肝癌的发展和不良预后具有相关性。本课题组前期的研究已发现 FGF19在肝癌中是促癌基因，它的表达水平与肝癌的增殖、迁移和侵袭等密切相关。在此研究基础上，本工作首次揭示促癌基因 FGF19在索拉非尼肝癌耐药过程中的重要作用，主要研究结果如下： 1. FGF19/FGFR4信号通路在肝癌耐药过程中的作用和调控机制 当 FGF19 过表达时可以抑制索拉非尼诱导肝癌细胞产生活性氧（ reactive oxygen species，ROS）和凋亡。相反，当 FGF19或者它的受体 FGFR4表达缺失时，将导致索拉非尼诱导肝癌细胞ROS产生水平升高和凋亡率增加。此外，在索拉非尼肝癌耐药细胞中敲减 FGF19可以显著的增强其对索拉非尼的敏感性。实验结果首次提出了抑制 FGF19/FGFR4 信号通路可以作为解决索拉非尼肝癌耐药的新措施。重要的是，普纳替尼作为第三代慢性粒细胞白血病抑制剂，通过增强索拉非尼处理肝癌细胞时 ROS相关的凋亡可以阻断 FGF19/FGFR4信号通路，这将为克服索拉非尼肝癌耐药问题提供新途径。因此，研究表明联合普纳替尼和索拉非尼或许可以提供一种有效治疗肝癌的方法。 2. FGF19在索拉非尼诱导肝癌细胞产生NO中的作用 肝细胞癌是主要来源于肝细胞的肿瘤，它的病死率位居世界第三位。我们前期的工作中已经介绍了 FGF19是一个致癌基因能够负调控酪氨酸激酶，然而索拉非尼的作用效果及其具体的分子机制至今仍然是未知的。因此，作者设想FGF19/FGFR4信号通路的存在可能影响索拉非尼对肝癌细胞的生长情况。 FGF19 过表达时能够减少索拉非尼诱导细胞产生的 NO水平，并且能够增强肝癌细胞的增殖能力。与此相反，当 FGF19的表达消失或者降低时，索拉非尼处理肝癌细胞时细胞释放NO的水平增加，同时它的受体FGFR4对药物的敏感性增强。研究也发现 BLU9931处理肝癌细胞时能够使 FGFR4失活，并且增强其对索拉非尼的敏感性。从实验数据可知 FGF19/FGFR4 信号通路在索拉非尼对肝癌细胞的作用效果中可能发挥一个关键的作用。所以，阻断 FGF19/FGFR4 信号通路对提高肝癌索拉非尼耐药病人的治疗效果或许可以提供一个潜在的治疗措施。 第二部分： 小分子化合物CYT997的抗癌新机理 头颈癌是全球第六大肿瘤，每年有 65万的新增病例和 35万的死亡病例。超过90%的头颈部肿瘤为鳞状细胞癌（HNSCC），因此头颈癌也被称为头颈部鳞状细胞癌。它起源于上呼吸道和上消化道黏膜上皮细胞。头颈癌的发生与环境和生活因素密切相关，包括吸烟，饮酒，UV 照射，尤其是化学品的接触以及人乳头瘤病毒的感染，其主要的致病因素是吸烟及过度饮酒。这类癌症常具有侵袭性，多数患者在确诊时已是晚期且伴随继发肿瘤。头颈癌的研究主要涉及口腔、口咽、下咽、喉及鼻旁窦鳞癌，其治疗方法主要采用放疗、化疗、靶向治疗和手术等综合治疗手段，但是头颈癌晚期患者的五年生存率仅有 40%-50%，治疗效果并没有显著的改变。因此，寻找新的化疗药物对头颈癌的治疗具有重要意义。本研究中选用小分子化合物 CYT997，一种细胞微管抑制剂，可以有效抑制头颈癌细胞的生长并同时加速头颈癌细胞的死亡，但是其具体的分子作用机制还不清楚，在此将进行详细的阐述： 1.小分子化合物CYT997诱导头颈癌细胞的凋亡 小分子化合物 CYT997 作用于头颈癌时可以抑制细胞的生长能力，在此过程中具体的诱导途径是未知的。因此，在本研究工作中主要是分析 CYT997 在诱导头颈癌细胞凋亡过程中的分子机制。本工作选用了细胞增殖实验对细胞的增殖能力进行了评估，同时借助于结晶紫染色和 DAPI 染色对细胞的凋亡率进行了检测， Western Blot 实验通过检测相关的凋亡蛋白表达水平变化评价了细胞的凋亡情况。电化学生物传感器和细胞 ROS荧光染色实验检测了细胞经过处理后 ROS的变化水平。通过上述实验我们发现不同的头颈癌细胞均表现出对 CYT997 具有较强的敏感性，从细胞增殖实验优化出药物对细胞的半数致死浓度为 100 nM。在CYT997 100 nM处理下，与HN12和HN30相比HN4对CYT997具有较强的敏感性。进一步的实验发现当药物处理头颈癌细胞一定时间后细胞的ROS水平呈现上升趋势，细胞的凋亡水平也具有相同的趋势。由此可知 CYT997 诱导的细胞凋亡是通过提高细胞产生ROS的水平来实现的。 2.自噬在CYT997诱导细胞凋亡中的作用 抗肿瘤药物在细胞凋亡与自噬功能之间的关系仍然是复杂的，而且具体的分子机制也是模糊不清的。这个研究的目的是研究新颖的微管破坏抑制剂 CYT997在作用于头颈癌细胞时自噬与凋亡之间的相互作用机制。为了研究 CYT997 在头颈癌中的作用效果，我们通过细胞增殖实验、DCFH-DA 荧光染色实验、电化学生物传感器、流式细胞术和 Western Blot 评估了细胞在药物作用下的氧化应激和凋亡水平。CYT997 触发的自噬情况是由自噬体荧光染色、透射电子显微镜和Western Blot实验来完成。最后选用HNSCC细胞构建的移植瘤小鼠模型评价药物对肿瘤增长的影响。 在头颈癌细胞中CYT997可以触发氧化应激相关的凋亡和mTOR依赖的自噬信号通路。CYT997 诱导的自噬具有保护细胞抵抗凋亡的作用，此作用是通过抑制高水平 ROS的产生实现的。降低 ATG7的表达水平或者使用HCQ来阻断自噬可以增强头颈癌细胞对CYT997的敏感性。此外，HCQ在触发头颈癌细胞移植瘤凋亡时也表现出和 CYT997 具有协同作用，而且没有细胞毒性。综上可知，联合使用 CYT997和自噬抑制剂可以增强 CYT997的抗肿瘤效果。同时该研究也进一步揭示了ROS在CYT997处理过程中平衡自噬与凋亡之间的重要性。因此，上述研究结果可以为探索头颈癌治疗新策略提供理论基础。

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