MUC1在慢性阻塞性肺疾病发病过程中的表达改变和初步机制研究

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【研究背景】：
　　慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是世界范围内高发病率和高死亡率的慢性疾病之一，它以渐进性不完全可逆的慢性气流受限为特征，并与吸烟或吸入有害颗粒或气体引起的异常炎症反应有关。大量研究证明，气道慢性炎症是COPD发病的核心内容，其形成机制十分复杂，涉及多种炎性细胞，在肺的不同部位有肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞的增加，激活的炎症细胞释放各种炎性介质如TNF-α，IL-8，从而损伤肺组织，促进COPD的发生和发展。
　　粘蛋白MUC1（人类用MUC1表示，动物用Muc1表示）是一种I型跨膜糖蛋白，分为细胞外区、跨膜区和胞内区，主要分布在呼吸道、胃肠道、生殖道上皮细胞以及免疫相关细胞表面。它对正常上皮起润滑和保护作用，同时它的胞内区还可以介导信号转导和细胞粘附功能。近期研究表明不论是铜绿假单胞菌感染还是呼吸道合胞体病毒感染引起的急性炎症中，都可以观察到 Muc1的表达量在感染后大量增加，而且这种表达增加与TNF-α、中性粒细胞弹性蛋白酶等的表达密切相关。从而提示 Muc1是在感染和炎症发生时起作用的重要内源性分子。
　　但在出现肺部慢性炎症的COPD患者中，肺中MUC1的表达水平如何，其表达水平是否也与炎症因子水平相关，目前尚不清楚。
　　【研究目的】：
　　本实验研究了不同来源标本，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者气道粘膜和不同时期的痰液标本，香烟烟雾诱导的COPD模型小鼠和细菌脂多糖诱导的急性炎症动物肺组织和支气管肺泡灌洗液，以及利用香烟烟雾提取物和细菌脂多糖直接刺激的A549细胞中MUC1的表达改变情况。并分别检测了COPD患者不同时期痰液中 IL-8和TNF-α水平及COPD小鼠和急性炎症小鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-α的水平。旨在揭示长期烟雾刺激和急性细菌脂多糖刺激后小鼠肺内Muc1的表达变化与TNF-α变化相关性，进而探讨COPD患者中MUC1的表达变化及其可能的机制，为COPD的发病机制提供新的理论基础，并为COPD的预防和治疗提供新的作用靶点。
　　【研究方法】：
　　本研究采用临床病人标本、动物实验和细胞培养相结合的方法。（1）通过纤支镜活检留取COPD患者的气道粘膜，采用免疫组化染色的方法来观察MUC1的表达水平。分别收集COPD病人急性期和缓解期的痰液标本，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测痰液上清中MUC1的量表达，同时检测痰液中TNF-α和IL-8的水平。（2）利用单纯熏烟6个月建立COPD小鼠模型，采用Western blot印迹法和ELISA检测COPD模型小鼠肺内Muc1表达水平，并检测支气管肺泡灌洗液中TNF-α的含量及细胞分类计数。（3）采用脂多糖滴鼻致敏C57小鼠后建立急性炎症动物模型，分别收集12h、24h、48h、96h、1w后的肺组织和支气管肺泡灌洗液，并分别采用Western blot和ELISA的方法检测各时间段的肺内Muc1的表达水平；同时检测小鼠肺泡灌洗液中TNF-α的水平；（4）采用细胞培养的方法，分别用香烟烟雾提取物和脂多糖刺激A549细胞24h后，收集细胞蛋白，采用Western blot的方法检测MUC1的表达水平。
　　【实验结果】：
　　一、COPD患者气道粘膜上皮MUC1的表达增加
　　1、在COPD患者的气道粘膜上皮MUC1免疫组化表达阳性且较正常气道粘膜的表达量增多。
　　2、COPD患者急性期痰液上清中MUC1胞内片段表达较缓解期明显升高，且痰液上清 IL-8水平、TNF-α水平均较缓解期升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；急性期痰液中白细胞总数、中性粒细胞总数及中性细胞比值均较缓解期明显升高（P<0.05）；经简单相关分析可知：急性期和缓解期的IL-8均与中性粒细胞比值成正相关（急性期，r=0.463，p=0.046；缓解期，r=0.547，p=0.015）；急性期和缓解期的中性粒细胞数与TNF-α的含量呈正相关（急性期r=0.489，P=0.040；缓解期r=0.794，P=0.000）。通过多元逐步回归分析发现，痰液MUC1水平受痰白细胞总数、FVC和年龄的影响。
　　二、熏烟动物模型实验结果
　　1、用单纯熏烟成功建立了COPD小鼠模型，其肺功能检测显示：气道阻力显著增加，肺顺应性、吸气峰流速和呼气峰流速显著下降，结果较正常组小鼠相比，差异具有统计学意义；且光镜下观察COPD小鼠肺组织的病理改变可见：支气管粘膜和肺实质中均有大量炎症细胞浸润，肺组织肺泡结构大小不一，部分肺泡间隔断裂，肺泡融合，肺泡腔扩大，呈现出典型的肺气肿病理改变。
　　2、COPD小鼠肺组织及BALF中Muc1表达量明显高于对照组正常小鼠，其差异具有统计学意义。COPD小鼠肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞数及巨噬细胞数均较对照组增加，TNF-α含量也较对照组明显增加，差异均具有统计学意义（P<0.05）。
　　三、急性炎症动物模型实验结果
　　1、运用脂多糖滴鼻成功建立急性炎症小鼠模型，光镜下观察模型组小鼠肺组织病理切片可见：肺间质明显水肿，肺实质和支气管粘膜中可见大量炎性细胞浸润。
　　2、经western blot检测小鼠肺组织Muc1胞内片段水平，脂多糖处理12h后小鼠肺Muc1胞内片段水平明显升高，且具有统计学意义；24h后已下降至与对照组无统计学差异，脂多糖处理48h、96h和1w后的小鼠肺中已检测不到Muc1胞内片段变化（与对照组相比）。BALF中Muc1胞内片段的表达量在各时间段一直处于较低水平，与对照组相比，无明显变化。然而，BALF中Muc1的胞外片段水平在12h时最高，24h开始下降，1周后下降至正常水平。脂多糖处理12h，24h，48h，96h，1w后的小鼠肺泡灌洗液中的细胞总数、中性粒细胞百分比均明显升高，较对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。并且，各时间段的肺泡灌洗液中TNF-α的含量均较对照组升高。
　　四、细胞实验结果分别用香烟烟雾提取物和脂多糖直接刺激A549细胞，24小时后收集细胞蛋白，均发现其中MUC1的表达量升高。
　　【实验结论】：
　　1、COPD患者气道粘膜上皮MUC1的表达量升高。
　　2、COPD患者急性期痰液的MUC1表达较缓解期痰液高。
　　3、MUC1水平升高与脂多糖和香烟烟雾提取物直接刺激有关。
　　4、COPD患者的MUC1水平的升高可能与长期烟雾刺激导致气道慢性炎症或细菌等刺激导致急性炎性相关。炎症反应诱导的的炎症介质升高，如TNF-α，以及中性粒细胞产物的增加可能与MUC1水平上调相关。

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作者
齐亚飞;
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作者单位

广州医科大学;

广州医学院;

展开▼
授予单位广州医科大学;广州医学院;
学科呼吸内科学
授予学位硕士
导师姓名郑则广,卢文菊;
年度 2012
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肺疾病;
关键词
慢性阻塞性肺疾病; 粘蛋白MUC1; 发病机制; 免疫组化染色;

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