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超高分辨率荧光显微镜中单分子识别和定位算法及抗漂移方法

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1 绪 论

1.1 引言

1.2 研究现状及意义

1.3本课题的研究目标

1.4 本文需要解决的关键问题

1.5 论文的内容安排

2 超高分辨率光学显微镜

2.1 远场光学显微镜分辨率极限

2.2 隐失波探测成像

2.3 远场增强分辨率光学显微镜

2.4 远场超高分辨率RESOLFT显微镜

2.5 远场超高分辨率定位显微镜

2.6 三维(f)PALM和(d)STORM成像

2.7 (d)STORM和(f)PALM图像重建现状

3 (f)PALM和(d)STORM成像系统搭建

3.1 (f)PALM和(d)STORM硬件系统搭建

3.2 f(PALM)和(d)STORM软件系统搭建

4 单分子定位荧光显微镜及定位算法理论

4.1远场光学显微镜点扩散函数

4.2 高斯近似

4.3 EMCCD

4.4单分子理论定位精度

4.5 基于CUDA的Levenberg-Marquardt非线性最小二乘拟合

5 超高分辨率图像重建算法SNSMIL

5.1 Rose判据和单分子闪烁质量

5.2 SNSMIL算法步骤

5.3 SNSMIL与其他算法比较

5.4 SNSMIL参数对识别精度和定位精度的影响

5.5 实验结果

5.6 SNSMIL实时分析能力

6 样本漂移修正

6.1 引言

6.2 二维样品漂移修正

7 总结与展望

7.1 全篇总结

7.2 正在进行的及后续研究工作的展望

致谢

参考文献

附录

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摘要

1873年,德国物理学家Ernst Abbe发现由于光的衍射,传统远场光学显微镜空间分辨率极限大约在250 nm(Abbe极限)。上世纪90年代以来,开发了多种用于突破Abbe极限的光学成像新技术和新方法。在这些技术和方法中,单分子定位显微镜(single molecule localization microscopy, SMLM),比如光活化定位显微镜(photoactivation localization microscopy,PALM)和随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM),基于识别和定位单分子荧光闪烁,可获得20-30 nm的横向分辨率和60-70 nm的轴向分辨率。
  在 SMLM方法中,所探测的为单分子荧光事件,由于单分子荧光信号微弱,及背景和噪声的存在,单分子事件的识别是一件富有挑战的工作。本文提出了一个实时,健壮的单分子荧光识别和定位算法(SNSMIL),该算法基于光子探测过程中噪声的内在特征(泊松噪声)的分析,即使在高背景和不均匀背景的条件下,也能极大提高单分子荧光事件的识别精度。为了完成实时数据分析,开发了运行在图形处理单元(GPU)上的软件,实现了大规模并行计算,达到数据采集和分析的同步。
  另一方面,一个典型的SMLM测量需要记录1000-100000帧的图片(成像速度为10-1000帧/秒),每次测量需要几分钟或更长的时间,由于力学弛豫,温度变化等原因,样品漂移(通常1-10 nm/s)不可避免,而SMLM成像的目标是几十纳米的超高分辨率图像,样品漂移会降低图像的分辨率,甚至使图像失真,已经成为不可忽略的问题。本文提出了一个亚纳米精度,低成本的抗样本漂移的方法。该方法同时记录荧光图像和明场图像,通过最小化明场图像之间的归一化均方根误差(normalized root-mean-square error,NRMSE),得到样品的漂移量,该方法不仅可以用于测量完成后的漂移修正,也可以用于测量中的实时漂移补偿。

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