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12-烷基化壳聚糖/反义内皮素转换酶RNA表达质粒复合体纳米粒在变应性气道炎症中的免疫调节作用

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论文说明：英文缩略语表

前言

第一部分12—ACSs的特性和体外基因转运效率研究

第二部分气道给予包裹反义ECE质粒的12—ACSs对OVA致敏的变应性气道炎症的影响

第三部分气道给予12—ACSs包裹的反义ECE质粒对OVA致敏的变应性气道炎症的免疫调节

附图

参考文献

综述 纳米药物在呼吸系统疾病治疗中的应用

致谢

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摘要

目的：本文主要探讨了一种新的免疫调节治疗模式：基于RNA干扰原理，我们构建了反义内皮素转换酶(antisenseECE)RNA表达质粒，与12-烷基化壳聚糖(12-ACSs)包裹形成复合体纳米粒，研究了该纳米粒对卵蛋白(OVA)致敏激发变应性气道炎症小鼠肺内活性内皮素(endothelin-1，ET-1)生成的影响，以及对变应性气道炎症的免疫调节治疗作用。 研究内容和方法： 第一部分：12-ACSs/antisenseECE质粒复合体纳米粒的特性和体外基因转运效率研究 通过透射电镜观察12-ACSs/antisenseECE质粒复合体纳米粒的形成、形态及大小；应用凝胶阻滞、结合平衡、DNA沉淀和DNA酶消化实验等检测12-ACSs对反义ECE核酸表达质粒的结合保护作用；通过MTT实验检测12-ACSs对细胞的毒性；通过离体培养细胞及活体动物转染实验观察12-ACSs能否携带反义ECE核酸表达质粒成功转染。 第二部分：气道给予12-ACSs/antisenseECE质粒复合体纳米粒，观察对OVA致敏小鼠变应性气道炎症的影响 腹腔注射OVA致敏后OVA雾化激发，建立小鼠变应性气道炎症模型，气道给予包裹反义ECE质粒的12-ACSs： 1.40只Balb/c小鼠随机分为正常对照(N)组，OVA致敏激发并给予包裹反义ECE质粒的12-ACSs(NM)组，OVA致敏激发(As)组，OVA致敏激发并给予裸DNA(DNA)组。除正常对照组，其它各组小鼠分别于第0、14日以OVA液腹腔注射致敏，第24、25、26日以OVA雾化激发，对照组用生理盐水；NM组于激发前24小时气道内注入包裹反义ECE质粒的12-ACSs，As组给予生理盐水，DNA组给予裸DNA。 2.末次激发后24h进行支气管肺泡灌洗(BALF)，计算BALF中细胞总数、分类计数。 3.肺组织病理切片，HE染色，观察各组小鼠肺组织的病理变化。 4.肺组织免疫组织化学检查肺组织中α-SMA 5.分离培养各组脾脏淋巴细胞，有或无OVA刺激培养脾细胞后取上清。制备肺匀浆上清。ELISA法检测肺匀浆、脾细胞培养上清IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10、IL-13和ET-1水平；BrdU法检测各组细胞的增殖水平。 6.分离研磨小鼠肺脏，提取蛋白，WesternBlot检测α-SMA表达变化。 第三部分：气道给予antisenseECE质粒复合体纳米粒对OVA致敏变应性气道炎症的免疫调节机制 1.分离培养各组小鼠脾脏淋巴细胞，以佛波酯、离子霉素刺激培养的脾细胞，莫能霉素作为阻断剂，流式细胞术检测CD3+CD4+/CD4-脾细胞及分泌IL-4、IFN-γ和CD4+CD25+的IL-10脾细胞比例。 2.分离研磨小鼠脾脏，提取核蛋白，WesternBlot检测调节性T细胞转录激活因子Foxp3表达变化。 结果： 第一部分：12-ACSs能够携载反义ECE核酸表达质粒成功转入离体培养的气道上皮细胞及小鼠在体气道上皮 1.电镜观察示成功制备包裹反义ECE质粒的12-ACSs纳米粒，粒径在100-150nm之间。 2.DNA琼脂糖凝胶电泳表明：12-ACSs与反义ECE核酸表达质粒在质量比为1：1时，全部反义ECE质粒被结合。应用DNaseI消化后可见，不同于裸DNA组，12-ACSs包裹的反义ECE质粒仍可在加样孔里观察到。 3.MTT检测结果显示：12-ACSs对16HBE细胞在低浓度下几乎没有毒性。 4.12-ACSs包裹的反义ECE核酸表达质粒的纳米粒能成功转染离体培养的气道上皮细胞及活体动物。 倒置荧光显微镜观察示：分别添加antisenseECE质粒或12-ACSs的16HBE细胞未见荧光。转染12-ACSs/antisenseECE质粒复合体纳米粒的细胞可见绿色荧光，但表达绿色荧光的细胞较对照脂质体+antisenseECE质粒组少。气道内滴注12-ACSs/antisenseECE质粒复合体纳米粒小鼠的肺组织冰冻切片观察发现：小鼠的支气管腔上皮细胞区域可见反义ECE表达质粒绿色荧光报告蛋白的表达。 第二部分：气道给予12-ACSs包裹的反义ECE核酸表达质粒减轻了卵蛋白致敏小鼠气道的变应性炎症 1.小鼠BALF细胞学检查与N组小鼠相比，As组、DNA组和NM组细胞总数、Eos百分比与Eos绝对计数均显著升高(P＜0.01)。NM组上述三种指标均显著低于As组和DNA组小鼠(P＜0.01)。As组和DNA组小鼠差异无统计学显著性意义。在BALF细胞涂片中，N组基本上看不见Eos，而在As组和DNA组可见显著增多的Eos，NM组较As组和DNA组明显减少。 2.小鼠肺组织病理改变与N组比较，As组和DNA组小鼠支气管、细支气管上皮下和小血管周围可见明显Eos浸润为主的炎症，NM组肺部炎症改变较As组和DNA组减轻。 3.脾细胞培养上清、肺匀浆细胞因子检测：在基础状态(无OVA刺激)下，脾细胞合成释放ET、IL-4、IL-5及IL-13水平在NM、As组和DNA组均明显高于N组(P＜0.05或P＜0.01)，以上各细胞因子水平在NM组小鼠低于As组和DNA组(P＜0.05或P＜0.01)，IFNγ水平各组的差异无显著性(P＞0.05)。NM、As组和DNA组脾细胞IL-10水平均低于N组(P＜0.05或P＜0.01)，但NM组IL-10的水平较As组和DNA组高(P＜0.05或P＜0.01)。肺匀浆结果同上述结果基本一致。OVA刺激后As组和DNA组脾细胞IL-4、IL-5和IL-13的释放率显著高于N组和NM组(P＜0.05或P＜0.01)，NM组与N组比较无显著差异。NM组IL-10的水平明显高于As组和DNA组(P＜0.05或P＜0.01)，与N组比较无显著差异，NM组IL-10的释放率则显著高于N组、As组和DNA组(P＜0.01)，IFN-γ、ET的释放率在各组间无明显差异。 4.免疫组织化学检查肺组织中α-SMA表达：正常N组气道上皮下仅见少量棕黄色α-SMA阳染，As组和DNA组小鼠气道上皮下可见棕黄色阳染明显增多，NM组较As组和DNA组有一定程度减少，但仍较N组强。 5.α-SMA在各组均有表达；N组明显少于其他3组，而As组和DNA组α-SMA的表达强于NM组。 第三部分气道给予12-ACSs包裹的反义ECE质粒对OVA诱导的变应性气道炎症的免疫调节 1.四组小鼠脾细胞流式细胞术检测结果：表达IL-4-CD4+：N(3.1％)，NM(3.3％)，As(5.9％)，DNA(6.6％)，表达IFN-γ-CD4：N(1.2％)，NM(1.6％)，As(1.7％)，DNA(1.6％)；IL-4-CD8+的细胞在四组中分别是N(1.4％),NM(1.2％)，As(2.9％)，DNA(2.3％)，表达IFN-γ-CD8+的细胞在四组中分别是N(0.5％)，NM(0.3％)，As(0.3％)，DNA(0.3％)。表达IL-10-CD4+CD25+的细胞在四组中分别是N(1.9％)，NM(4.3％)，As(3.4％)，DNA(3.1％)。2.Foxp3在各组均有表达；N组明显少于其他3组，而NM组Foxp3的表达强于As组和DNA组。 结论：1.12-ACSs能够成功包裹反义ECE核酸表达质粒并运送到目的组织和细胞，反义ECE表达质粒能够在16HBE细胞及小鼠气道表达，12-ACSs是一种相对低毒、安全的基因载体。 2.气道内给予包裹反义ECE核酸表达质粒的12-ACSs纳米粒治疗，可以通过RNAi机制干扰内皮素转换酶生成，限制大内皮素转换为活性内皮素，减少ET的合成，减轻变应性气道炎症。 3.反义ECE质粒抑制ET生成下调了Th2淋巴细胞亚群的活化，减少了Th2的细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的释放，上调了调节性T细胞的活性，从而抑制了变应性气道炎症，并且减轻了气道重塑。因此，12-ACSs包裹的反义ECE核酸表达纳米微粒是一个有未来应用前景的变应性呼吸道炎症的基因治疗载体。

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