NK细胞通过上调miR-146b-5p抑制WBSCR22表达调控奥沙利铂耐药大肠癌细胞增殖及侵袭的机制研究

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目的：自然杀伤细胞（NK cells）具有良好的抗肿瘤应用前景。本实验中我们将建立奥沙利铂耐药结直肠癌细胞模型，阐明 NK细胞对奥沙利铂耐药细胞的细胞活力、增殖、迁移及侵袭能力的影响，从而探索与NK共培养的结直肠细胞内miR-146b-5p的表达水平变化，阐明WBSCR22与miR-146b-5p之间的调节关系，最后探索miR-146b-5p在NK细胞抑制奥沙利铂耐药大肠癌细胞恶性进展中的作用。方法：将结直肠癌细胞RKO和DLD1用RPMI-1640培养基培养，加入奥沙利铂溶液建立耐药细胞株。通过CCK-8细胞增殖实验，克隆形成实验检测OR-DLD1和OR-RKO细胞的体外增殖活力和克隆形成能力。通过transwell小室细胞侵袭实验检测OR-DLD1和OR-RKO细胞的体外迁移及侵袭能力的变化。荷瘤试验检测NK细胞对OR-DLD1和OR-RKO细胞的异体成瘤能力的影响。体内外实时荧光定量PCR和Western blot实验检测 OR-DLD1和 OR-RKO细胞中，WBSCR22的mRNA和蛋白的表达水平,以及miR-146b-5p的mRNA表达水平。通过 miRNA在线靶标预测网站 miRanda，克隆构建了连接有WBSCR22基因3’UTR序列的双荧光报告基因质粒，并对预测的miR-146b-5p作用位点进行突变得到突变质粒。建立了稳定敲低 miR-146b-5p表达的细胞株，并与 NK细胞共培养或共注射，探索OR-DLD1-anti-control, OR-DLD1-anti-miR-146b-5p, OR-RKO-anti-control和OR-RKO-anti-miR-146b-5p细胞株的体内外功能差异。结果： 1在 DLD1和 RKO细胞基础上，建立了耐药细胞株并命名为OR-DLD1和OR-RKO，相对DLD1和RKO细胞，OR-DLD1和OR-RKO细胞在奥沙利铂作用下细胞增殖活力和克隆形成能力都显著性增强。 2与NK细胞共培养的奥沙利铂耐药细胞株OR-DLD1和OR-RKO的体外增殖活力、克隆形成、迁移及侵袭能力均显著性下降，与 NK细胞共注射的奥沙利铂耐药细胞株OR-DLD1和OR-RKO的体内成瘤能力显著性下降。 3通过实时荧光定量PCR实验我们发现，相对未与NK共培养的对照细胞，与 NK细胞共培养的 OR-DLD1和 OR-RKO细胞中， WBSCR22的mRNA表达水平均显著性下调。通过Western blot实验我们发现，相对未与 NK共培养的对照细胞，与 NK细胞共培养的OR-DLD1和OR-RKO细胞中，WBSCR22的蛋白质的表达水平均显著性下调。相对与未与 NK细胞共培养的细胞，与 NK细胞共培养的细胞中 miR-146b-5p表达显著性上调。我们提取 BALB/c裸鼠体内的OR-DLD1和OR-RKO移植瘤细胞中的miRNA，并通过实时荧光定量PCR实验发现，相对与未与NK细胞共注射的移植瘤细胞，与NK细胞共注射的移植瘤细胞中miR-146b-5p表达显著性上调。 4双荧光报告基因实验表明 miR-146b-5p能显著抑制连有WBSCR22的3’UTR野生型质粒的荧光素酶活性，而对突变型质粒的荧光素酶活性没有明显的影响。NK细胞共培养的细胞中连有WBSCR22的3’UTR野生型质粒的荧光素酶活性显著降低，而突变型质粒的荧光素酶活性没有明显的变化。 5抑制miR-146b-5p的表达后，NK细胞对OR-DLD1和OR-RKO细胞在细胞活力、增殖、迁移及侵袭的抑制被显著性削弱。结论： 1 OR-DLD1和OR-RKO细胞是对奥沙利铂耐药的耐药细胞株。 2 NK细胞能抑制奥沙利铂耐药结直肠癌细胞株的体内外细胞活力、增殖、迁移及侵袭能力。上述实验表明， NK细胞能通过上调 miR-146b-5p的表达来抑制WBSCR22的mRNA及蛋白的表达水平。miR-146b-5p能通过靶向WBSCR22的3’UTR抑制WBSCR22的表达。 3 MiR-146b-5p是NK细胞抑制奥沙利铂耐药肠癌细胞细胞活力、增殖、迁移及侵袭的关键性效应分子。

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作者
赵海燕;
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作者单位

重庆医科大学;

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授予单位重庆医科大学;
学科肿瘤学
授予学位博士
导师姓名吴忠均;
年度 2018
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正文语种中文
中图分类
关键词
癌细胞增殖; 抑制; 表达调控; 奥沙利铂; 耐药; 大肠; 侵袭;

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