ILK与RI的相互作用通过ILK信号通路调节膀胱癌EJ细胞EMT的分子机制研究

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目的：
　　研究整合素连接激酶（ILK）与核糖核酸酶抑制因子（RI）蛋白的相互作用，探讨两者相互作用对膀胱癌EJ细胞的ILK信号通路及EMT影响的分子机制。
　　方法：
　　1.根据ILK基因序列设计引物，经PCR法扩增获得ILK基因片段后，分别连接到真核表达载体 pEYFP-N1和 pCMV-3xflag-CMVTM-10上。通过酶切和DNA测序鉴定载体，并分别命名为pEYFP-N1-ILK and pCMV-3×Flag-ILK。将pCMV-3×Flag-ILK载体和对照空白载体，以及LV5-RNH1和 LV5NC分别稳定转染 EJ细胞株，命名为 EJ-ILK， EJ-FLAG，EJ-RI和 EJ-LV5，经 Western blot和细胞免疫荧光检测蛋白过表达情况。
　　2.在EJ和HEK293细胞内进行ILK与RI的免疫共沉淀实验，荧光共振能量转移实验和免疫荧光共定位实验，用以研究体内的相互作用。在细胞外应用GST pulldown实验研究ILK与RI在体外的相互作用。
　　3.CCK8检测各组细胞增殖能力；流式细胞术检测细胞周期；细胞免疫荧光检测蛋白RI,ILK,p-Akt和p-GSK3β表达水平；小管形成实验检测ILK和RI相互作用对体外血管生成的影响。
　　3.收集的稳定表达细胞株EJ-ILK，EJ-FLAG，EJ-RI，EJ-LV5和EJ,用Western blot检测ILK与RI相互作用对EJ细胞EMT及ILK信号通路的影响。
　　5.构建BALB/C裸鼠移植瘤模型，观察移植瘤生长，肿瘤微血管生长以及肺转移情况；应用免疫组化和组织免疫荧光检测肿瘤组织中EMT相关蛋白及ILK信号通路关键蛋白的表达水平。另外，在临床人膀胱癌及癌旁组织标本中同时检测了ILK及RI蛋白的表达。
　　结果：
　　1.测序结果显示：重组真核表达质粒 pEYFP-N1-ILK和pCMV-3×flag-ILK构建正确。细胞免疫荧光和Western blot结果显示ILK和RI在EJ细胞中成功过表达。
　　2.实验结果显示： ILK与RI在体内和体外均存在相互作用。
　　4.CCK8结果显示EJ-ILK细胞增值能力较对照组明显增强，而EJ-RI细胞则明显减弱；流式细胞分析结果表明EJ-RI细胞与对照组相比，明显阻滞于S期；小管形成实验提示RI和EJ相互作用能够抑制体外血管的形成。
　　3.通过检测各组稳定表达细胞株，显示EMT相关蛋白和ILK信号通路的一些关键靶蛋白呈现显著的变化。
　　5.BALB/C裸鼠注射各组细胞后，与2个对照组相比，EJ-ILK组瘤重明显增加；而EJ-RI组与对照组比较，瘤重明显降低。组织免疫荧光和HE染色结果提示EJ-ILK组微血管明显增加，EJ-RI组则明显减少。肺组织HE染色实验表明，EJ-ILK组有明显肺转移，而EJ-RI组未见明显转移。免疫组织化学和免疫荧光检测结果显示：EJ-ILK组中EMT及ILK信号通路蛋白变化明显；EJ-RI组中EMT相关蛋白和ILK通路关键蛋白与对照组比较有显著变化，且与EJ-ILK组成反相关。
　　结论：
　　1.ILK和RI在体内外均存在相互作用。
　　2.过表达ILK促进细胞增殖，EMT以及转移。
　　3.上调RI抑制ILK信号通路以及EMT。
　　4.上调RI抑制血管生成，肿瘤形成以及转移。

著录项

作者
庄翔;
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作者单位

重庆医科大学;

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授予单位重庆医科大学;
学科细胞生物学
授予学位硕士
导师姓名陈俊霞;
年度 2016
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类膀胱肿瘤;
关键词
整合素连接激酶; 核糖核酸酶抑制因子; 相互作用; 上皮间质转化; 信号通路; 膀胱癌; 动物模型;

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