联合DNA回路和石墨烯/聚苯胺/金纳米复合材料用于bcr/abl融合基因的检测

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bcr/abl融合基因是慢性粒细胞白血病（CML）的分子生物学标志物。bcr/abl融合基因的检测被广泛用于CML的早期诊断和药物疗效监测。尤其 bcr/abl融合基因的高灵敏检测对于微小残留病灶的诊断至关重要。因此，研究简便、低成本、高灵敏的bcr/abl融合基因检测方法具有重要的临床意义。
　　目的：以bcr/abl融合基因为靶物质，联合DNA回路和石墨烯/聚苯胺/金纳米复合材料的优点，通过转换器茎环（Transducer hairpin， HP）的设计构建通用型的DNA回路。结合DNA循环通路无酶信号放大和纳米材料增加电极表面积的优点，构建一种成本低、灵敏度高、特异性强且通用的电化学传感器。
　　方法：①电极表面的材料修饰：将预合成的石墨烯/聚苯胺（GS/PANI）复合材料固定在玻碳电极表面，待干后电沉积金纳米，以制备石墨烯/聚苯胺/金纳米修饰的玻碳电极（GS/PANI/AuNPs/GCE）。②捕获探针的固定：捕获探针在Au-S键的作用下结合到纳米材料修饰的电极表面。③DNA循环通路的核酸反应和信号放大：靶物质与探针HP、H1和 H2在中反应液中发生杂交反应，通过催化茎环自组装（Catalyzed hairpin assembly）打开探针H1、H2的茎环结构。靶物质的循环利用使信号得到放大。DNA循环通路的产物H1:H2进一步结合到电极表面参与产生电化学信号。④检测条件的优化：对检测探针的浓度、茎环碱基个数和探针孵育时间进行探索以优化信噪比。⑤电化学DNA传感器的性能考察：在优化条件基础上，对不同浓度靶物质进行检测以得到标准曲线，并对传感器的稳定性和重复性进行分析。⑥实际标本的检测：将构建好的DNA传感器用于阳性标本、阴性标本和空白对照的检测。
　　结果：⑴扫描电镜、能谱分析表征了材料的成功合成并修饰到电极上。原子力电镜证实捕获探针在电极上的成功固定。应用电化学阻抗法和循环伏安法表征电极上的材料修饰和核酸反应。⑵用差分脉冲法定量分析不同浓度的靶物质，绘制标准曲线。在优化条件下，靶物质浓度在10～20000 pM范围内其信号与靶物质浓度呈线性相关，R2=0.991，计算得到最低检测限为1.05 pM（S/N=3）。⑶将制备好的传感器在4℃保存两周后，检测信号可以保持初始信号的92.6％。将同批次的5个DNA传感器用于检测不同浓度的靶物质（20 pM,50 pM,100 pM）时得到的相对标准偏差分别是5.26%，4.59%和4.43%。⑷该DNA传感器在检测实际标本时，bcr/abl融合基因高表达的K562细胞和CML患者骨髓细胞的电化学信号远高于阴性标本和空白对照。本方法构建的传感器在检测实际标本时可以较好的区分出阳性和阴性标本。
　　结论：通过联合石墨烯/聚苯胺/金纳米复合材料和DNA循环通路的优点，一方面纳米复合材料增大了电极表面积，另一方面DNA循环通路进一步使信号被放大，因而提高了检测灵敏度。该传感器在提高灵敏度的同时改善了DNA循环通路的通用性，并且使DNA循环通路的核酸序列设计更简便。该传感器在实际标本的检测中取得了较满意的结果。

著录项

作者
陈雪萍;
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作者单位

重庆医科大学;

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授予单位重庆医科大学;
学科临床检验诊断学
授予学位硕士
导师姓名冯文莉;
年度 2016
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总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类慢性白血病;实验室诊断;
关键词
慢性白血病; 生物标志物; 基因表达; DNA传感器;

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