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LYTAK1抑制人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移和间质化机制的研究

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前言

第一部分 TAK1和TGF-β1在PVR患者玻璃体液以及血清中的表达

1材料与方法

2.结果

3.讨论

4.小结

第二部分 LYTAK1对TGF-β1诱导的人视网膜色素上皮细胞增殖和移行的影响

1.材料与方法

2. 结果

3. 讨论

4.小结

第三部分 LYTAK1抑制TGF-β1诱导的人视网膜色素上皮细胞间质化机制的研究

1. 材料与方法

2.结果

3.讨论

4. 小结

参考文献

全文总结

文献综述:增殖性玻璃体视网膜病变发生机制及治疗进展

致谢

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摘要

研究背景：
　　增殖性玻璃体视网膜病变（Proliferative vitreoretinopathy，PVR）是孔源性视网膜脱离（rhegmatogenous retinal detachment，RRD）以及行视网膜复位手术后的一种并发症。PVR的病理变化涉及细胞去极化、迁移、黏附、增殖等一系列细胞活动过程，此外还与分泌胶原等细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的异常有关；经过上述病理过程之后，在视网膜前后表面以及玻璃体中将形成具有收缩能力的增殖膜，由于后者的收缩，从而造成牵拉性视网膜脱离（tractional retinal detachment，TRD）。在近年来的研究中，PVR的发生以及其机制一直是眼底病研究的热点及难点。视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial，RPE）处于视网膜光感受器细胞层的外围，其结构由一层排列整齐的六角形细胞组成。目前的研究已证实， RPE细胞对 PVR的发生和发展至关重要。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）为PVR的发生和发展过程中的重要环节。EMT是指具有上皮样表型的细胞，当其失去极性后活动能力增强，在细胞间质之间能够自由移动并且表现出纤维样表型的转化过程。EMT通常分为三种亚型：其一，是原肠胚形成，机体中原始的上皮细胞通过EMT参与多种细胞的生物胚胎发育及器官的形成中；其二，为内皮或者第二上皮转化为组织成纤维细胞，从而在机体的伤口愈合以及器官的纤维化过程中发挥重要作用；其三，是上皮来源的细胞失去极性，从而转化为具有侵袭能力的细胞。
　　转化生长因子β活化激酶-1（ transforming growth factor-β activated kinase-1，TAK1）为 MAP3K家族中的主要成员之一，属于色氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其活性受到TGF-β以及骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)的调控。在生物机体中，TAK1经由P38、JNK以及NF-κ B通路活化实现对一系列特异性细胞转录因子的调控，从而影响细胞的生存、分化等生理病理过程，同时还对炎症反应具有调控作用。由于 TAK1功能具有多样性，因此 TAK1在炎症性疾病中成为了主要的靶激酶。除此之外，TAK1还参与了 MKK3/4-P38/JNK-AP-1以及IKK-NF-κ B等重要信号转导通路的活化，对细胞的存活、分化以及炎症应答具有十分重要的调控作用。转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）为一类新发现的具有对细胞分化和生长起调节作用的多功能细胞因子，大量研究证实，TGF-β是目前已知的具有促进组织纤维化的最重要的细胞因子，其在肾纤维化、肝纤维化和肺纤维化的患者血液中高表达。研究表明，TGF-β在PVR的发生和发展过程中发挥了重要作用，但其具体作用和机制并不十分清楚，尚需进一步深入研究。
　　目的：
　　本课题旨在明确：1.TAK1在TGF-β1诱导的人RPE细胞间质化过程中的作用；2.探讨TAK1抑制剂LYTAK1对RPE细胞间质化的作用；3.研究LYTAK1对RPE细胞间质化的作用机制，旨在为PVR的治疗奠定实验基础。
　　方法：
　　1.采用ELISA法检测2014年6月~2014年12月期间在云南省第一人民医院眼科30例PVR患者、20例IMH患者以及同期15例正常志愿者,分别检测玻璃体液和/或外周血中TGF-β1和TAK1的表达水平。所有患者的年龄均在45~65岁之间。其中，PVR患者中有男性为18例，女性为12例；IMH患者中男性为8例，女性为12例；健康志愿者中男性为9例，女性为6例。
　　2.将0.01 ng/mL TGF-β1作用于人RPE细胞株ARPE-19，培养24 h后采用荧光定量PCR法检测细胞中TAK1 mRNA的表达；分别用不同浓度的LYTAK1（0μM、1μM、10μM、25μM、50μM）作用于0.01 ng/mL TGF-β1诱导后的ARPE-19细胞，western blot法检测细胞中TAK1蛋白的表达；Transwell小室法检测细胞的侵袭能力；流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染色法）检测细胞的凋亡情况；细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。
　　3.采用荧光定量 PCR法分别检测对照组、TGF-β1+DMSO组以及 TGF-β1+LYTAK1组ARPE-19细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和纤维粘连蛋白（fibronectin） mRNA的表达。采用western blot法分别检测对照组、TGF-β1+DMSO组以及TGF-β1+LYTAK1各浓度组（0μM、1μM、10μM、25μM、50μM）ARPE-19细胞中a-SMA、fibronectin、p-Smad2、p-Smad3、IKKα、NF-κBp65蛋白的表达。
　　结果：
　　1. PVR和IMH两组间TAK1的浓度存在显著差异（t=3.114，P=0.035<0.05），即PVR患者玻璃体中TAK1的浓度显著高于IMH组；对PVR和正常组两组的间血清 TAK1浓度是否存在差异性进行比较分析，结果表明两组间 TAK1的浓度存在显著差异（t=3.156，P=0.034<0.05），即PVR患者血清中TAK1的浓度显著高于IMH组。上述结果表明，PVR患者玻璃体以及血清中TAK1的含量均显著高于IMH患者，血清中的TAK1含量也明显高于健康人群，提示其可能对PVR的发生以及发展过程具有促进作用。PVR患者、IMH患者以及健康志愿者的玻璃体液和/或血清中TGF-β1的浓度存在显著差异（t=2.319，P=0.033<0.05），即PVR患者玻璃体中TGF-β1的浓度显著高于IMH组。对PVR和正常组两组间的血清TGF-β1浓度是否存在差异性采用t检验进行比较分析，结果表明两组间TGF-β1的浓度存在显著差异（t=3.312，P=0.037<0.05），即PVR患者血清中TGF-β1的浓度显著高于IMH组。上述结果表明，PVR患者玻璃体和/或血清中TGF-β1的含量均显著高于IMH患者以及健康人群，提示其与PVR的发生以及发展过程有关。
　　2.荧光定量PCR检测结果表明，TGF-β1处理组ARPE-19细胞中TAK1 mRNA的表达显著高于对照组，TGF-β1能够明显增高TAK1蛋白的表达，而当用不同浓度的 LYTAK1作用细胞后，细胞中 TAK1蛋白的表达量均发生不同程度的降低（P<0.05），其中当LYTAK1的浓度为25μM时TAK1蛋白的表达量最低。CCK-8检测表明，当 LYTAK1作用24 h时，各浓度组细胞的增殖活性均未见显著变化（P>0.05）；而当LYTAK1作用48 h以及72 h之后，随着LYTAK1作用浓度的增加，当LYTAK1作用浓度为50μM时对ARPE-19细胞的增殖活性的抑制率最高。ARPE-19细胞的增殖活性逐渐降低，表明LYTAK1对ARPE-19细胞的活性呈剂量依赖性。Transwell小室法检测结果表明，LYTAK1各浓度组与对照组相比视野平均侵袭细胞数量显著减少，且随着LYTAK1浓度的增高其侵袭细胞数量逐渐降低，提示LYTAK1对ARPE-19细胞的侵袭具有抑制作用，且呈剂量依赖性。流式细胞术检测结果表明，随着LYTAK1作用浓度的升高，ARPE-19细胞的凋亡率也随着上升，提示LYTAK1诱导ARPE-19细胞凋亡呈现一定的剂量依赖性。细胞划痕实验结果表明，48 h后各浓度LYTAK1作用组ARPE-19细胞的迁移距离较对照组明显缩短（P<0.05）；且随着LYTAK1浓度的增高，细胞的迁移距离逐渐降低，提示LYTAK1抑制ARPE-19细胞迁移呈现一定的剂量依赖性。
　　3.与对照组相比，TGF-β1+DMSO组以及TGF-β1+ LYTAK1组中a-SMA和fibronectin mRNA的表达均明显增高；而相较于 TGF-β1+DMSO组，TGF-β1+LYTAK1组中a-SMA和fibronectin mRNA的表达量显著降低。Western blot法检测结果表明，TGF-β1+DMSO组细胞中a-SMA、fibronectin、p-Smad2、p-Smad3、IKKα、NF-κBp65蛋白的表达均显著高于对照组。TGF-β1+ LYTAK1各浓度组细胞中a-SMA、fibronectin、p-Smad2、IKKα、NF-κBp65蛋白的表达随 LYTAK1浓度的增高而逐渐降低，呈剂量依赖性，而LYTAK1对p-Smad3蛋白的表达无显著影响。
　　结论：
　　1. PVR患者血清以及玻璃体中TAK1和TGF-β1的表达量显著增高，其表达上调可能与PVR的发生和发展有关。
　　2. TGF-β1能够显著上调ARPE-19细胞中TAK1的表达；
　　3. LYTAK1能够明显抑制ARPE-19细胞中TAK1的表达，且呈剂量依赖性；
　　4. TGF-β1能够通过上调ARPE-19细胞中TAK1、a-SMA、fibronectin、p-Smad2、p-Smad3、IKKα、NF-κBp65的表达，促进EMT的发生和发展；而LYTAK1能够通过抑制TAK1、a-SMA、fibronectin、p-Smad2、IKKα、NF-κBp65的表达发挥抑制EMT的发生和发展。
　　5. LYTAK1能够明显抑制ARPE-19细胞的增殖活性、细胞凋亡、侵袭及迁移，且呈剂量依赖性。

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