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BMP9诱导永生化脐带间充质干细胞成骨效应及p300参与永生化机制的研究

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前言

参考文献

第一部分 人脐带间充质干细胞的分离培养及永生化细胞株的构建

前言

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第二部分 BMP9诱导永生化脐带间充质干细胞的成骨分化潜能鉴定

前言

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第三部分 P300参与调控脐带间充质干细胞永生化相关机制的研究

前言

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第四部分Mir-26b-5p下调p300对脐带间充质干细胞增殖作用研究

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

综述:SV40T永生化细胞的相关分子机制探讨

致谢

博士期间发表论文

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摘要

研究背景：来源于健康新生婴儿的围产期医疗废弃物-脐带的人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）具有自我更新和多向分化潜能，其理想的成骨分化潜能在骨组织再生工程方面的临床应用中有巨大潜力。BMPs（Bone morphogenetic protein，骨形态发生蛋白）在MSCs的成骨分化过程中具有重要调控作用，其中以BMP9的诱导分化效应尤为明显，在hUC-MSCs上的应用有待于进行深入研究。
　　原代hUC-MSCs分离步骤繁琐，获取途径有限，体外扩增培养要求较高，不同实验室间易出现差异；这些技术缺点限制了其功能和机制研究方面的进一步深入，因此，需要寻求hUC-MSCs的规模化培养和基础应用的新方法，干细胞永生化是解决这一难题的重要可行性途径之一，有效避免培养过程中细胞老化，干性逐渐消失的现象。
　　本课题运用前期构建的PiggyBac转座系统“无痕”导入SV40大 T抗原基因，构建永生化的hUC-MSCs细胞，对干细胞相关细胞表面分子标记，增殖活性和分化能力等一系列生物学特性进行鉴定。体内外实验证实BMP9诱导 iUC-MSCs（ immortalized human umbilical cord mesenchymal stem cells）的成骨分化效应和相关机制研究，为hUC-MSCs在骨组织工程方面的应用提供的理论依据。
　　第一部分人脐带间充质干细胞的分离培养及永生化细胞株的构建
　　目的：分离培养人脐带间充质干细胞并构建永生化细胞。
　　方法：采用Ⅰ型胶原酶消化法从脐带组织中分离培养人脐带间充质干细胞，体外连续培养传代，流式细胞术检测细胞表面分子标记，hUC-MSCs转染pMPH86质粒DNA和具有转座酶活性的Ad-GFP-Base，潮霉素B抗性筛选阳性细胞克隆群，观察细胞形态学，连续培养传代并分批次冻存；WB检测iUC-MSCs中SV40T的蛋白表达，将表达翻转重组酶活性的Ad-FLP感染iUC-MSCs后 RT-PCR检测处理后细胞的SV40Tag基因表达。
　　结果：成功分离培养人脐带间充质干细胞，可见细胞形态大多呈长梭形及少量多角形，呈集落样增殖；间充质干细胞的特异性标记物 CD73， CD90， CD105均为阳性表达，而CD34，CD45和HLA-DR均为阴性表达；hUC-MSCs转染后通过潮霉素B抗性筛选得到细胞克隆群，形态与原代细胞相似，SV40T蛋白呈阳性表达，FLP处理后，RT-PCR结果显示iUC-MSCs的SV40T基因被敲除。
　　结论：通过PiggyBac转座系统导入SV40T，成功构建iUC-MSCs并通过FLP的基因重组效应逆转永生化，为进一步研究hUC-MSCs的自我更新和多向分化潜能获得了理想的细胞模型。
　　第二部分 BMP9诱导永生化脐带间充质干细胞的成骨分化潜能鉴定
　　目的：鉴定iUC-MSCs的生物学特性和BMP9诱导其成骨、成脂、成软骨分化潜能。
　　方法：检测iUC-MSCs的表面分子标记，通过细胞计数、MTT、结晶紫染色比较hUC-MSCs和iUC-MSCs的增殖活性，经FLP处理后比较细胞增殖活性；裸鼠皮下成瘤实验检测其生物安全性，iUC-MSCs经BMP9诱导后三向分化能力的鉴定：RT-qPCR对三系分化相关基因表达水平进行检测；检测ALP活性，茜素红和油红O染色分别检测钙结节和脂滴的形成；裸鼠皮下注射BMP9诱导分化iUC-MSCs建立成骨模型，观察皮下包块的形成，对离体骨进行Micro-CT扫描分析，脱钙处理并进行H&E，油红O，Alcian Blue和 Masson Trichrome组化染色并观察比较。
　　结果：iUC-MSCs表面分子标记基本符合干细胞特征，细胞增殖能力较原代细胞更强，经FLP处理后增殖活性有所降低，但仍能传4-5代；移植到裸鼠体内的iUC-MSCs未形成异常增殖，证明其生物安全性良好；RT-PCR结果显示经BMP9刺激后，三系分化相关基因的mRNA水平均明显增加，BMP9诱导iUC-MSCs的ALP活性亦明显增强，ALP染色的阳性表达，亦能够促进iUC-MSCs的钙盐沉积和脂滴形成；动物实验和microCT、组织化学染色检查显示，iUC-MSCs经BMP9诱导后在裸鼠皮下注射位点异位成骨，成脂、成软骨。
　　结论：iUC-MSCs的增殖活性较原代细胞更好，体内外经BMP9诱导发现其具有成骨、成脂、成软骨的多向分化潜能。
　　第三部分 P300参与调控脐带间充质干细胞永生化相关机制的研究
　　目的：检测人脐带间充质干细胞体外长期培养过程中自我更新、细胞衰老和诱导分化能力等特性的改变，早/晚期代数原代细胞和永生化细胞之间比较P300和多潜能转录因子的基因和蛋白表达水平的变化，探讨与永生化相关可能机制。
　　方法：检测hUC-MSCs早期（P3-5）和晚期（P15,P25）细胞增殖能力，克隆形成能力的差异，经BMP9诱导后ALP活性读数的比较；细胞衰老特异性β-gal染色检测hUC-MSCs早期和晚期细胞，FLP处理和未处理的永生化细胞的细胞衰老水平，RT-qPCR和WB检测p300和多潜能转录因子表达水平的变化，及β-catenin不同位点磷酸化水平的变化。
　　结果：hUC-MSCs晚期细胞的增殖活性、CFU-F、成骨早期指标ALP活性均明显低于早期细胞，细胞衰老特异性β-gal活性明显增强，而永生化细胞未表达β-gal活性， FLP处理后广泛性低水平表达β-gal活性。hUC-MSCs晚期和永生化细胞的p300基因mRNA表达水平明显下降，而蛋白水平恢复至早期细胞表达水平，Nanog基因表达水平变化与p300蛋白表达变化相类似，而Oct4和Sox2则没有显著性差异；β-catenin的S675位点磷酸化水平与p300/Nanog表达水平变化相类似。
　　结论：hUC-MSCs长期培养过程中干性有所衰减，永生化细胞则保持干性，p300/Nanog与β-catenin的S675位点磷酸化参与了转化调控。
　　第四部分 Mir-26b-5p下调p300对脐带间充质干细胞增殖作用研究
　　目的：探讨潜在microRNA靶向下调 p300表达水平对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响。
　　方法：通过双荧光素酶报告基因（Firefly/Renilla Luciferase）系统筛选出作用于 p3003'-UTR的目标 microRNA， mimic转染 UC-MSCs后RT-qPCR检测miRNA表达水平的变化，Western Blotting检测p300蛋白水平变化，RT-qPCR和Western-bloting检测多潜能转录因子表达水平的变化，MTT法检测UC-MSCs增殖能力的变化，并比较克隆形成能力的差异。
　　结果：证实mir-26b-5p通过不完全互补配对结合p300的3’-UTR区，显著降低了荧光素酶的相对活性；mir-26b-5p mimic转染后抑制p300蛋白表达水平，并下调Nanog基因和蛋白表达水平；mir-26b-5p mimic转染后UC-MSCs的增殖受到抑制，克隆形成能力下降。
　　结论：UC-MSCs高表达mir-26b-5p能够显著抑制p300蛋白表达和干性相关基因Nanog的表达，并且抑制UC-MSCs的增殖能力和克隆形成能力。

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