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基于RNA-seq技术的尼古丁影响下中间神经元和锥体神经元转录组分析

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英汉缩略语名词对照

前言

1 材料与方法

1.1 主要设备与试剂

1.2 实验动物与分组

1.3 小鼠繁殖以及鉴定

1.4 药物处理

1.5 单细胞悬液制备

1.6 单细胞分选

1.7 单细胞扩增

1.8 测序

1.9 测序分析

1.10 RT-PCR验证

2 结果

2.1 单细胞的分选

2.2 测序的总体情况

2.3 差异表达基因的筛选

2.4 中间神经元和锥体神经元差异基因数据分析

2.5 尼古丁对中间神经元的差异基因数据分析

2.6 尼古丁对锥体神经元的差异基因数据分析

2.7 差异基因的PCR验证

2.8 尼古丁共同调节基因

3 结论与讨论

3.1 结论

3.2 讨论

参考文献

附图

附表

文献综述:阿尔茨海默病与生长激素释放抑制因子

致谢

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摘要

研究目的:
　　通过两种标记中间神经元以及锥体神经元的荧光转基因小鼠，分别给予尼古丁处理，手工分选得到荧光细胞，利用 RNA测序(RNAsequencing, RNA-Seq)技术研究两种神经元的基因表达情况,并考察尼古丁对两种神经元的基因表达的影响。
　　研究方法:
　　1.6只雄性成年绿色荧光标记SST阳性中间神经元转基因小鼠GIN和6只雄性成年黄色荧光标记锥体神经元的转基因小鼠YFPH分别随机分为处理组和对照组,每组3只,分别用微型渗透泵持续泵入48 mg/kg/d尼古丁酒石酸氢溶液或生理盐水14天,共分为四组,分别是GIN盐水对照组、GIN尼古丁处理组、YFPH盐水对照组和YFPH尼古丁处理组。
　　2.药物处理结束后,从每只小鼠大脑皮层组织急性分离得到单细胞悬液，在荧光显微镜下手工分选收集GFP和YFP标记的荧光细胞各30个。利用SMARTer试剂盒进行微量RNA扩增得到cDNA，然后采用单细胞RNA-Seq技术进行测序,测出的读段利用Bowtie、Tophat以及Cufflinks等生物信息学工具比对到小鼠参考基因组上并获取每个转录本fragment以及FPKM两个数据。
　　3.采用FPKM方法估计基因表达水平,用EBseq算法，以fragments值为对象,以i) Fold Change>2 or<0.5;ii) FDR<0.05为标准得到差异表达基因DEGs，一方面确定在中间神经元生理盐水对照组和锥体神经元生理盐水对照组发生显著变化的基因。另一方面确定在中间神经元和锥体神经元尼古丁处理后发生显著变化的基因。基于筛选出的差异表达基因,进行Gene Ontology功能分类以及KEGG生物学通路分析。
　　研究结果:
　　1.通过分析中间神经元盐水对照组和锥体神经元盐水对照组的转录本表达水平,发现3185个DEGs。这些差异基因中，与多个GO tree功能富集分类如转运、神经系统发育、磷酸化、神经突触可塑性调节等相关。并且通过独有基因分析，寻找潜在的两神经元marker基因。
　　2.通过分析每个转录子在中间神经元尼古丁处理组和盐水对照组的表达水平，有809个DEGs。在这些基因中,与多个GO富集分类如神经发育、转录调控及信号转导等相关。在中间神经元中，尼古丁影响了代谢通路如烟酸和烟酰胺代谢、维生素B6代谢、甘油磷脂代谢、醚脂类代谢以及甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸代谢等信号通路。
　　3.通过分析每个转录子在锥体神经元尼古丁处理组和盐水对照组表达水平,确定了YFPH荧光转基因小鼠中在尼古丁处理后表达水平显著变化的基因有731个。在这些基因中,与多个GO富集分类如趋化性、免疫反应、药物反应、以及PI3K等相关。在锥体神经元中，尼古丁影响了以及嘧啶代谢、嘌呤代谢、钙信号、黑素原合成等相关信号通路。
　　4.利用单细胞RT-PCR，选取部分关键基因进行验证，在GIN和YFPH中发现Dlx1仅在GIN标记的中间神经元表达，在GIN中，尼古丁升高了Pld1，Ppap2b的表达，在YFPH中，尼古丁升高Flt1而降低Nme4和 Entpd，初步证实了单细胞RNA-seq结果的可靠性。
　　研究结论:
　　1.通过对单细胞手工分选的改进，成功分选出活性较好的荧光细胞，结合单细胞扩增试剂盒，扩增微量RNA用于构建了单细胞文库完成测序。
　　2.测序结果中得到的中间神经元和锥体神经元差异基因与已发现的差异基因吻合度高。和传统芯片相比，深度测序能更好的发现基因表达情况，极大的丰富了两个细胞亚型差异的数据。
　　3.在尼古丁处理后，中间神经元和锥体神经元的差异表基因的重合率很低,说明尼古丁作用具有细胞特异性。
　　4.在差异表达基因的基础上,对差异基因进行了后续功能以及信号通路分析。表明尼古丁对小鼠中间神经元和锥体神经元作用方式不一样。

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