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论文1：小型猪骨髓间充质干细胞经心导管冠状动脉移植及其迁移和分化的实验研究;论文2：骨髓间充质干细胞多向分化潜能的实验研究

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论文1小型猪骨髓间充质干细胞经心导管冠状动脉移植及其迁移和分化的实验研究

论文2骨髓间充质干细胞多向分化潜能的实验研究

结语

全文结论

参考文献

文献综述蛋白质组与心血管疾病

致谢

攻读学位期间发表的论文

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摘要

目的 在建立小型猪骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemceUs．MSCs)的体外分离和培养方法的基础上探讨小型猪心导管介入冠状动脉治疗模型，观察自体MSCs经心导管介入冠状动脉移植后在心肌内的迁移及分化情况，为MSCs移植治疗心血管疾病提供切实可行的方法。 方法 选用心脏及冠状动脉解剖生理特点与人类相似的小型猪，穿刺小型猪的髂后上嵴抽取骨髓，经密度梯度法离心得到骨髓单个核细胞，接种后形成单层贴壁细胞，通过换液和传代纯化MSCs，用形态学方法鉴定培养的MSCs。待MSCs扩增达到10。～10。时，经DAPI标记后应用心导管技术将体外培养扩增的小型猪自体MSCs移植进入左冠状动脉前降支。用免疫荧光检测即刻移植和移植后6w移植细胞的细胞肌钙蛋白T(CardiacTroponinT，cTnT)、缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)、anti一Ⅷfactor的表达。 结果 经培养存活的MSCs原代和一代呈纺锤型、多边型或星型。至二代起呈均一纺锤型，似成纤维细胞样，长宽比例约为2～3：1。体外培养的原代MSCs8～10d达到融合，传代后仍具有较强的增殖能力。经心导管介入冠状动脉成功进行了自体MSCs移植，且移植细胞存活，MSCs自冠状动脉移植处向心肌组织迁移，分散分布；部分MSCs向心肌细胞方向分化，局部心肌组织出现新生毛细血管；未见炎症及排斥反应。对照即刻组MSCs聚集成团状，未有迁移及分化出现。 结论 小型猪MSCs可在体外分离、纯化、扩增；应用心导管术进行自体MSCs移植成功，并可进行准确的定位和动态观测，为临床应用提供了一个可靠的技术平台。自体移植后的MSCs在心肌内存活，并且在多种因素的作用下可以从移植处向心肌组织内迁移，部分细胞发生分化。 目的 体外以成年Wistar大鼠为研究对象，观察5一氮杂胞苷(5-azacyt埘ine，5-aza)诱导MSCs分化为心肌样细胞的分化率以及MSCs向神经细胞和骨细胞分化的情况，确认MSCs含有不同组织类型的定向干细胞。 方法 以成年Wistar大鼠为研究对象，体外分离、纯化、培养大鼠MSCs，将原代MSCs接种在装有盖玻片的细胞培养板中，待细胞铺满玻片90％～95％后，用5-aza(终浓度为10umol／L)诱导24h。DAPI标记细胞，每张爬片随机选取6个非重复视野，用免疫荧光方法动态检测诱导前及诱导后24h、3d、1w、2w、4w的cTnT、Cx43的表达。同时建立空白对照组(培养基中不加诱导剂)，cTnT、Cx43。设立实验对照组，与诱导组同一时间点动态检测巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NeuronSpecificEndolase，NSE)、I型胶原蛋白(CollagenTypeI，CTI)的表达，用改良Kaplow氏法检测细胞内碱性磷酸酶(intra—cellularalkalinephosphatases，CAKP)的表达，分别计算cTnT、Cx43、Nestin、NSE、CTI、CAKP的表达百分比及其变化情况，并在倒置显微镜下观察诱导前后细胞形态的变化及对照组细胞形态的变化。 结果 体外实验中，诱导后细胞胞体增长，胞浆增多，有多个分叉，形态和个数各不相同，细胞之间出现连接，细胞排列趋向一致，但未观察到自发搏动，cTnT在诱导前及诱导后24h、3d、1w、2w、4w的平均表达率依次为0、2．9％、8．5％、11．8％、22．2％、32．6％；Cx43在诱导前及诱导后24h、3d、1w、2w、4w的平均表达率依次为O、3．9％、8．1％、16．4％、23．6％、34．6％。空白对照组(未诱导)中只有少量细胞形态上胞体增长，出现分叉，呈现心肌样细胞特点，cTnT的平均表达率依次为：O、0、O、2．1％、4．1％、6．6％；Cx43的平均表达率依次为：O、0、0、2．2％、4．1％、7．1％；实验对照组中少量细胞形态上呈圆形，立题感增强，有突触出现，呈现神经样细胞特点，Nstin的平均表达率依次为0、0、0、2．7％、5．2％、6．9％；NSE的平均表达率依次为O、0、0、L7％、2．8％、6．5％；少量细胞形态上多边形，连接紧密，胞体立方形或矮柱状形，表面有许多细小突起，呈现骨样细胞特点，I型胶原蛋白的平均表达率依次为0、0、0、1．9％、3．9％、6．2％，CAKP的平均表达率依次为0、0、O、O、1．9％、4．4％。 结论 MSCs是非均质性的，其中可能含有不同分化方向的干细胞亚群，即含有向不同组织细胞分化的定向干细胞群，其具有潜在的分化为相应组织细胞的能力。 生物有机体的各种生理活动和病理活动都是通过蛋白质来实现的。当今生命科学研究的重点已从单纯的基因信息研究转移到蛋白质组的研究上来。由于蛋白质组已经成为后基因组时代功能基因组学研究的核心技术，在心血管疾病的分子机制解释中，其扮演着越来越重要的角色。这必将为阐明心血管疾病发病机制提供新思路，为其诊断和治疗提供新方法，在药物的研究和开发中也将起到重要作用。

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