黄瓜绿斑驳花叶病毒外壳蛋白与寄主烟草蛋白间的互作

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1 前言

1.1 黄瓜绿斑驳花叶病毒研究进展

1.1.1 黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生及危害

1.1.2 CGMMV的症状

1.1.3 CGMMV基因组结构与功能

1.1.4 CGMMV的寄主范围和传播途径

1.1.5 CGMMV的防治

1.2 酵母双杂交系统及其在植物病毒学中的应用

1.2.1 酵母双杂交系统的原理

1.2.2 酵母双杂交系统的特点

1.2.3 酵母双杂交系统的发展

1.2.4 酵母双杂交系统在植物病毒学的应用

1.3 双分子荧光互补技术

1.4 免疫共沉淀技术

1.5 本研究的目的和意义

2 CGMMV外壳蛋白基因的克隆及酵母表达载体的构建

2.1 实验材料

2.1.1 供试毒源、菌株、质粒

2.1.2 PCR引物

2.1.3 主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1 黄瓜病叶总RNA的提取

2.2.2 RT-PCR扩增CGMMV CP

2.2.3 CGMMV CP目的片段的回收

2.2.4 目的片段的回收产物与pMD18-T克隆载体连接

2.2.5 连接产物转化大肠杆菌DH5α

2.2.6 重组质粒的鉴定

2.2.7 pDBLeu酵母表达载体的改造

2.2.8 酵母表达载体的构建

2.3 结果与分析

2.3.1 CGMMV CP基因的PCR扩增

2.3.2 重组克隆载体的鉴定

2.3.3 阳性克隆的测序鉴定

2.3.4.pDBLeu酵母表达载体的酶切回收

2.3.5 重组酵母表达载体的鉴定

2.4 小结与讨论

3 利用酵母双杂交技术筛选烟草cDNA文库

3.1 实验材料

3.1.1 菌株、质粒

3.1.2 PCR引物

3.1.3 主要试剂

3.2 实验方法

3.2.1 MaV203感受态细胞的制备

3.2.2 重组质粒转化酵母菌MaV203

3.2.3 3AT浓度的测定

3.2.4 含有诱饵质粒pDB-CP的酵母感受态细胞的制备

3.2.5 烟草cDNA文库的筛选

3.2.6 X-Ga1活性检测

3.2.7 阳性克隆酵母质粒的提取

3.2.8 阳性克隆中文库质粒插入片段的克隆

3.2.9 阳性克隆的测序及分析

3.2.10互作蛋白全长酵母表达载体的构建

3.3 结果与分析

3.3.1 阳性克隆的筛选

3.3.2 PCR鉴定cDNA插入片段

3.3.3 阳性克隆的测序及分析

3.3.4 互作蛋白全长基因的克隆

3.3.5 互作蛋白全长基因酵母表达载体的构建

3.3.6 互作蛋白全长与CP的互作验证

3.4 小结与讨论

4 CGMMV与烟草蛋白互作的进一涉验证

4.1 实验材料

4.1.1 载体质粒和菌株

4.1.2 PCR引物

4.1.3 主要试剂

4.2 实目佥方法

4.2.1 CP,RPL14基因的扩增

4.2.2 扩增产物的电泳检测和回收

4.2.3 表达载体的构建

4.2.4 农杆菌EHA105感受态的制备

4.2.5 重组质粒转化农杆菌EHA105

4.2.6 含有重组质粒的农杆菌EHA105的鉴定

4.2.7 含有重组质粒的农杆菌注射本氏烟及瞬时表达

4.2.8 本氏烟烟草叶片总蛋白的提取及免疫共沉淀分析

4.2.9 SDS-PAGE电泳及Western blot检测

4.3 结果与分析

4.3.1 表达载体的构建

4.3.2 含有重组质粒的农杆菌EHA105的鉴定

4.3.3 双分子荧光互补技术验证互作

4.3.4 免疫共沉淀验证CP与RPL14间的互作

4.3.5 互作蛋白的定位

4.4 小结与讨论

5.全文总结和展望

参考文献

附录1 载体图谱

附录2 所用主要试剂与缓冲液的配制

致谢