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间隙连接蛋白Cx43在慢性砷诱导人肺支气管上皮细胞间质转化中的作用

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目的：
　　探讨间隙连接蛋白43（Connexin43，Cx43）在慢性砷诱导上皮间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）中的作用及可能的分子机制。
　　方法：
　　1.BEAS-2B的处理
　　采用0.25μM的亚砷酸钠持续作用永生化正常人肺支气管上皮细胞BEAS-2B45天，即为慢性砷暴露；慢性砷暴露BEAS-2B细胞及由软琼脂克隆形成实验获得的转化BEAS-2B细胞为实验所保存。
　　2.Western Blot检测正常BEAS-2B、慢性砷诱导45天BEAS-2B和转化BEAS-2B三种不同细胞中的Cx43表达水平。
　　3.构建Cx43过表达细胞系和Cx43敲减细胞系
　　将Cx43过表达载体（pDsRed-Express-C1-Cx43）转染正常、转化BEAS-2B细胞，Cx43干扰质粒（pGPU6/RFP/Neo-Cx43）转染正常BEAS-2B细胞，加G418筛选14天，挑取单克隆培养从而获得Cx43过表达细胞系和Cx43敲减细胞系。
　　4.软琼脂克隆形成实验检测Cx43过表达以及敲减后，不同BEAS-2B细胞克隆形成能力的变化。
　　5.细胞划痕实验检测正常BEAS-2B细胞和转化BEAS-2B细胞过表达Cx43前后细胞迁移能力的改变。
　　6.Western Blot检测Cx43过表达和敲减后上皮细胞标志蛋白E-Cadherin、间质细胞标志蛋白Vimentin、MEK、ERK1/2和p-ERK1/2表达水平。
　　7.用MEK抑制剂U0126阻断MEK/ERK1/2信号通路后，观察EMT相关标志物、MEK/ERK1/2信号通路相关信号分子表达水平的变化。
　　8.统计学方法
　　所有实验结果均采用SPSS23.0软件进行分析。所有数据均采用X±SD进行比较。两组之间计量资料比较采用t检验，多组之间用ANOVA分析，P＜0.05认为有统计学意义，所有统计图均采用GraphPad Prism6软件进行绘制。
　　结果：
　　1.成功转染pDsRed-Express-C1-Cx43和PGPU6/RFP/Neo-Cx43BEAS-2B细胞，获得Cx43过表达细胞系和Cx43敲减细胞系。
　　2.软琼脂克隆形成实验结果表明Cx43过表达及敲减均能影响细胞克隆形成率。
　　在各组细胞克隆形成率的比较中，可见Cx43转染转化BEAS-2B组（3.01±0.20%）明显低于转化BEAS-2B组（10.22±0.41%），Cx43敲减组（正常BEAS-2B细胞敲减Cx43，4.03±1.04%）高于正常BEAS-2B组（2.50±1.01%），且转化BEAS-2B组显著高于正常BEAS-2B组。
　　结果表明Cx43能够抑制细胞克隆形成率。
　　3.细胞划痕实验表明Cx43过表达能够抑制转化BEAS-2B细胞的迁移能力。体现在12h和24h转化BEAS-2B组细胞迁移距离（24.05±3.02,59.06±2.01）明显大于正常BEAS-2B组（6.07±1.56,27.66±4.06）,且Cx43转染转化BEAS-2B组（20.15±2.86,52.04±1.89）较转化BEAS-2B组迁移距离（24.05±3.02,59.06±2.01）明显缩短。
　　4.Western Blot实验检测EMT标志物表明：上皮标志蛋白E-Cadherin的表达与Cx43正相关，间质标志蛋白Vimentin的表达与Cx43负相关。
　　结果发现，Cx43转染转化BEAS-2B组E-Cadherin表达水平（0.73±0.08）较转化BEAS-2B组（0.30±0.08）升高，而Vimentin表达水平下降（0.48±0.24,2.41±0.21）；Cx43敲减组E-Cadherin（0.18±0.01）较正常BEAS-2B组（1.17±0.19）下降，而Vimentin表达水平（1.58±0.13,1.05±0.10）上升。
　　5.Western Blot实验检测信号通路相关分子蛋白及EMT标志物表达水平，结果显示：
　　5.1 过表达和敲减Cx43，MEK和ERK1/2的表达均无明显变化（P＞0.05），但p-ERK1/2在各组细胞中的表达发生了变化，即Cx43过表达各组p-ERK1/2表达水平均低于其对照组（P＜0.05），而Cx43敲减组p-ERK1/2表达水平高于正常BEAS-2B组（P＜0.05），表明Cx43能够影响ERK1/2的磷酸化。
　　5.2 加入MEK抑制剂U0126后，ERK1/2磷酸化水平在一定程度上受到抑制。同时检测EMT标志物可见E-Cadherin表达水平较抑制前均有升高（P＜0.05），且Cx43过表达组较其对照组升高水平更明显（P＜0.05）；而Vimentin表达水平较抑制前降低（P＜0.05），且Cx43过表达组较其对照组降低水平更显著（P＜0.05），因此说明Cx43能促进E-Cadherin的表达，抑制Vimentin的表达。
　　结论：
　　1.间隙连接蛋白Cx43能够抑制慢性砷诱导的人肺支气管上皮细胞克隆形成能力和细胞迁移能力。
　　2.间隙连接蛋白Cx43能促进E-cadherin的表达,抑制Vimentin的表达。
　　3.间隙连接蛋白Cx43可能通过MEK/ERK1/2信号通路抑制砷诱导的人肺支气管上皮细胞间质转化。

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