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巴戟天粗多糖修复实验性精索静脉曲张大鼠下丘脑-垂体-睾丸轴生殖损伤及Vasopressin对GnRH神经元分泌活性的影响

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摘要

目的：1）探讨巴戟天多糖修复精索静脉曲张所致下丘脑-垂体-睾丸轴损伤的作用和机制；2）探究血管加压素（AVP）能否直接影响促性腺激素释放激素（GnRH）神经元合成和分泌活性。
　　内容：1）自主提取巴戟天粗多糖，观察其对精索静脉曲张睾丸形态、血管发生及下丘脑神经内分泌的作用；2）组织水平观察血管加压素直接作用于 GnRH神经元的证据，细胞水平检测AVP对GnRH合成和分泌活性的影响。
　　方法：1）水提醇沉法提取巴戟天粗多糖，并采用紫外、红外光谱，凝胶渗透色谱（HPGPC）和单糖衍生化分析其基本信息；2）建立实验性左精索静脉曲张（ELV） SD大鼠模型，术后给予巴戟天粗多糖灌胃给药5周；GT1-7细胞用于体外研究含药血清或AVP对GnRH神经元的作用；3）采用苏木素-伊红（HE）染色、尼氏染色、高尔基染色等研究睾丸和下丘脑基本形态特征；采用酶联免疫吸附法检测血清GnRH、AVP、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）和睾酮（T）水平；采用免疫荧光组织化学染色、免疫印迹和实时荧光定量 PCR（q-PCR）等检测组织和细胞蛋白表达和转录情况；4）观察生殖障碍大鼠尿/水比、血压、血清和下丘脑 AVP与GnRH的相关变化，寻找二者共变的相关性；采用邻位连接（PLA）和免疫电镜观察AVP与GnRH的共定位；采用蛋白组学初步探索AVP对GnRH神经元的作用；q-PCR和双荧光素酶报告基因实验（Luciferase）检测GnRH转录活性及启动子活性的变化；同时进行细胞毒性实验、细胞周期检测、细胞内 Ca2+测定和 ATP检测以观察AVP对GnRH神经元的作用。
　　结果：1）本实验采用的巴戟天粗多糖中碳水化合物含量达91%；紫外光谱未见明显蛋白或核酸污染；红外光谱可见多糖特征性吸收峰；HPGPC示一高尖的主峰，数均分子量（Mn）1141 Daltons，重均数均比Mw/Mn1.444；化学构成为葡萄糖：半乳糖：木糖：果糖：麦芽糖：蔗糖=7.63：1.23：0.95：0.72：0.87：0.64。
　　2）与ELV组比较，50 mg/kg-100 mg/kg巴戟天粗多糖显著修复ELV大鼠性行为能力，提高双侧附睾精子计数，降低精子畸形率（P＜0.05）；50 mg/kg-100 mg/kg巴戟天粗多糖显著升高ELV大鼠血清GnRH、FSH、LH和T水平（P＜0.05），修复双侧睾丸生精上皮结构，减少生精细胞异常凋亡，减轻间质水肿和血管增生（P＜0.05）；100mg/kg巴戟天粗多糖修复患侧睾丸效果优于50mg/kg，且相对上调血管生成因子VEGF和MMPs表达水平（P＜0.05）；50 mg/kg-100 mg/kg巴戟天粗多糖显著增加ELV大鼠下丘脑Arc神经元树突棘密度（P＜0.05），增加功能性树突棘数量（P＜0.05）；50 mg/kg-100 mg/kg巴戟天粗多糖显著上调下丘脑Kiss1-GPR54系统表达水平，增加下丘脑GnRH转录活性和表达水平（P＜0.05）；50 mg/kg-100 mg/kg巴戟天粗多糖治疗的ELV大鼠血清能促进GT1-7细胞GnRH合成和分泌（P＜0.05），上调GPR54和Oct-1、SCIP水平（P＜0.05），促MAPKs磷酸化（P＜0.05）。
　　3）实验性精索静脉曲张大鼠随疾病进展，尿量增多（P＜0.05），血压下降（P＜0.05），血清和下丘脑GnRH和AVP显著降低（P＜0.05），且AVP降低幅度较GnRH更早，更明显（P＜0.05）；在大鼠下丘脑弓状核检测到GnRH-AVP PLA阳性信号，免疫电镜也在该部位同一神经末梢内同时观察到GnRH和AVP阳性物；50-200 pg/ml AVP处理6h，GT1-7细胞内ATP和Ca2+水平显著增高（P＜0.05），GnRH转录水平显著升高（P＜0.05），GnRH启动子活性显著增高（P＜0.05），细胞内GnRH相关转录因子Oct-1和SCIP水平也显著增高（P＜0.05），Erk1/2和p38磷酸化水平显著增高（P＜0.05）；1000pg/ml以上AVP无刺激GnRH合成和分泌的表现，且可能引起GT1-7细胞Ca2+超载，ATP合成障碍，细胞增殖受抑。特异性阻断GPR54受体后，50-200 pg/ml AVP促进GnRH合成的作用显著受抑（P＜0.05），而高浓度（1000 pg/ml以上）AVP的细胞毒性作用无明显改变。此外，PLA和免疫共沉淀发现AVP与GPR54之间可能存在相互作用。iTRAQ分析200 pg/ml AVP给药6小时前后 GT1-7细胞，发现 AVP处理组和空白组差异表达蛋白相关性较高的通路主要有半胱氨酸-蛋氨酸代谢通路，脂肪酸代谢通路，丙酮酸代谢通路，脂肪酸合成通路，Ⅰ型糖尿病相关通路，嗅觉转导通路。
　　结论：1）50mg/kg-100mg/kg巴戟天粗多糖能够有效修复实验性精索静脉曲张进展期大鼠生殖功能，提高精子质量，修复睾丸损伤，修复下丘脑神经元突触可塑性，上调Kiss1-GPR54系统，促进GnRH合成与分泌。
　　2）AVP可能直接作用于GT1-7细胞，增强GnRH启动子活性，促进GnRH合成和释放，该作用可能通过与GPR54受体直接或间接的相互作用实现；此外，AVP可能通过上调GnRH神经元GPR54受体水平，增强Kiss1-GPR54系统的作用，进而刺激GnRH的合成和分泌。

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