基于SELEX的表皮生长因子受体(EGFR)DNA核酸适体筛选的实验研究

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表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体（Human EGF receptor,HER）家族成员之一，属于I型跨膜酪氨酸激酶受体。广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面。EGFR在生理条件下，其通过调节细胞分化及细胞形态在组织生长及发育过程中起重要作用。然而，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，如胶质瘤、皮肤癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌。此外，EGFR过度表达与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭转移及细胞凋亡的抑制有关。EGFR高表达还与胶质母细胞瘤放疗耐受性有关，抑制EGFR可以增加胶质母细胞瘤放疗敏感性。因此，EGFR已成为研究重要的靶点之一。目前抗EGFR的药物包括 EGFR单克隆抗体西妥昔单抗（Cetuximab）及蛋白激酶抑制剂吉非替尼（Gefitinib）。由于两者均属于蛋白类，其化学修饰困难及强免疫原性，限制其使用及效果。核酸适体是经配体指数富集系统进化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX）技术筛选出的能特异结合蛋白质或其他物质的寡聚核苷酸片段，具有比抗体更好的化学性质，与各种大小分子具有高选择性和高亲和力，此外，还具有无毒性、无免疫原性等优点，这使得在蛋白质研究中显示出很好的作用，特别是在检测肿瘤生物标志物研究中。通过SELEX技术可以简便且快速获得高特异性及高亲和力的核酸适体，在生物医学基础研究和临床诊断与治疗方面显示出巨大的应用前景。目前血管内皮细胞生长因子（VEGF）核酸适体作为药物已经过FDA批准进入临床，治疗年龄相关性黄斑变性。EGFR RNA核酸适体已筛选出，但由于RNA核酸适体很容易被核酸酶降解，及筛选过程复杂及费用昂贵，限制其使用。而DNA核酸适体具体稳定、不易被核酸酶降解、易于合成、费用低廉、易储存的特点，更具有更广阔的应用空间。本实验组选择单链DNA核苷酸作为初始库进行EGFR核酸适体的筛选。
　　本文用重组EGFR（胞外区）为靶蛋白，Ni磁珠作为反筛蛋白，以76个碱基随机单链DNA寡核苷酸库作为初始库，经过11轮筛选，获得22条与靶蛋白EGFR-磁珠高特异性和高亲和力的DNA核酸适体。对第11轮库进行解离常数（Kd）的测定，测得Kd=107±26 nM，而对照初始库与靶蛋白基本不结合。其中，选择其中一条核酸适体命名为TuTu22，并将筛选出的核酸适体TuTu22与EGFR阳性表达的细胞株U251、U87、A431及EGFR表达阴性的细胞株Jurkat细胞进行表征，发现TuTu22与高表达EGFR的U251、U87、A431细胞特异性结合。此外，核酸适体TuTu22不与EGFR阴性表达的Jurkat细胞结合。因此，筛选出的核酸适体TuTu22经过进一步优化后可在生物传感器及纳米技术等方面有广泛用途，也可能成为一种新型的靶向治疗药物。

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作者
王灯亮;
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作者单位

福建医科大学;

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授予单位福建医科大学;
学科外科学(神外)
授予学位博士
导师姓名康德智,杨朝勇;
年度 2014
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类癌细胞生物学;基因的表达;
关键词
肿瘤细胞; 核酸适体; 细胞增殖; 基因表达;

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