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现场藻华爆发期间东海原甲藻细胞周期定量蛋白质组学研究

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摘要

缩略词表

第一章 前言

1.1 海洋甲藻及其藻华概述

1.1.1 甲藻和有害藻华

1.1.2 主要藻华物种

1.1.3 甲藻藻华形成机制

1.2 细胞周期研究概况

1.2.1 细胞周期概述

1.2.2 细胞周期调控的分子机理

1.2.3 甲藻细胞周期调控

1.3 蛋白质组学及其在甲藻细胞周期研究中的应用

1.3.1 蛋白质组学概况

1.3.2 甲藻细胞周期蛋白质组学研究进展

1.4 本文研究目的和内容

第二章 材料与方法

2.1 样品采集

2.2 细胞计数

2.3 流式细胞分析

2.3.1 现场样品预处理

2.3.2 样品测定及分析

2.4 光合色素及营养盐样品采集

2.4.1 光合色素分析

2.4.2 营养盐分析

2.5 蛋白质样品处理与分析

2.5.1 蛋白质提取

2.5.2 还原烷基化

2.5.3 蛋白质定量

2.5.4 SDS电泳

2.5.5 蛋白质酶解与iTRAQ标记

2.5.6 液相分离

2.2.7 蛋白质的液质联用分析

2.2.8 蛋白质生物信息学分析

第三章 藻华现场东海原甲藻细胞周期时相界定及相关参数研究

3.1 结果

3.1.1 藻华现场东海原甲藻细胞周期时相界定

3.1.2 细胞密度变化

3.1.3 细胞色素变化

3.1.4 浮游植物类群表征

3.1.5 营养盐浓度变化

3.2 讨论

3.3 本章小结

第四章 藻华现场东海原甲藻细胞周期定量蛋白质组学研究

4.1 结果

4.1.1 蛋白质鉴定及质谱数据质量控制

4.1.2 蛋白质功能分布

4.1.3 差异表达蛋白质统计和分布

4.1.4 差异表达蛋白质通路富集分析

4.1.5 细胞周期相关蛋白质的鉴定及定量

4.1.6 G1期中期差异表达蛋白

4.2 讨论

4.2.1 Gp-VS-Gm差异表达蛋白KEGG通路富集分析

4.2.2 Gm-VS-Ga差异表达蛋白KEGG通路富集分析

4.2.3 Ga-VS-S差异表达蛋白KEGG通路富集分析

4.2.4 S-VS-M差异表达蛋白KEGG通路富集分析

4.2.5 M-VS-Gp差异表达蛋白KEGG通路富集分析

4.2.6 细胞周期相关蛋白质

4.2.7 不同细胞周期时相重要生物学过程比较(以G1期中期为主)

4.3 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 本论文的特色和创新点

5.3 不足及展望

参考文献

附录

硕士在读期间论文及学术研究情况

致谢

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摘要

东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)是中国近海主要有害藻华种,几乎每年都会引发大规模的有害藻华,对海洋生态系统、海洋生物资源和水产养殖造成了严重威胁,并且影响公众健康。尽管目前对东海原甲藻藻华形成的海洋学和生态学机制开展了大量研究,但对现场藻华形成过程中东海原甲藻细胞生长调控的分子机制知之甚少。
  本论文以现场东海原甲藻藻华为研究对象,运用基于质谱的定量蛋白质组学技术-iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术,并结合相应的转录组数据,比较研究了现场藻华细胞不同细胞周期时相的蛋白质表达谱,确认、鉴定了差异表达蛋白,分析了细胞周期进程中重要功能蛋白的差异表达及其参与的生物学过程,从蛋白质组角度探讨了现场甲藻细胞周期调控机理和藻华爆发的分子机制。主要研究结果如下:
  (1)光学显微镜和浮游植物色素表征结果表明,藻华爆发现场的主要物种为东海原甲藻。藻华现场与实验室培养的东海原甲藻的细胞周期时相一致,均在24小时内完成一个完整的细胞周期,且每个细胞周期时相持续时间相同,表明藻华的爆发并不是细胞异常增殖的结果,而可能是细胞生长累积和聚集的结果。此外,细胞密度、色素含量和营养盐浓度等在一个细胞周期内也呈现较大的波动趋势,可能与不同细胞周期细胞内发生的生物学过程相关。
  (2)本研究鉴定到6,118个高可信度蛋白质,其中两个特有肽段及以上的蛋白质有2,595个,它们主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、翻译、折叠分选降解和能量代谢等过程。不同细胞周期时相的蛋白质表达谱的比较研究发现,在G1期,细胞内发生的主要生物过程包括碳水化合物、能量代谢和氨基酸代谢;在S期和G2/M期,细胞则主要进行DNA复制和修复、泛素调节的蛋白质降解与蛋白质合成等过程。这些过程随细胞周期时相时序性表达,它们的协同作用确保了细胞增殖和各种代谢活动的正常进行。
  (3)本研究鉴定到8种在不同细胞周期时相存在表达差异的细胞周期相关蛋白,它们在调控细胞周期进程中起重要作用。其中CDK2、CDC48、CDC37、PCNA和E3s在S期表达量最高;DIP13的表达量在M期达最大值。在G1中期(Gm),CDK2、FtsH和D1P13的表达量最低,而Skp1和MAPK的表达量最高;在G1前期(Ga)和后期(Gp)这些蛋白质的表达量差异不大。CDK2作为参与细胞周期调控的重要内源性分子首次在甲藻细胞中被鉴定到。
  (4) Gm是现场海区光照强度和海水温度最高的一个时期。相比于其它四个时期,该期细胞中有52个蛋白质的表达显著上调,128个蛋白质的表达显著下调,它们主要参与复制、转录、翻译、修饰及蛋白质降解,能量代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢等过程。此外,与实验室培养的东海原甲藻相比,Gm期细胞内发生的主要生物学过程存在一定的差异:ABC转运、ROS清除防御机制和光能捕获等过程高表达;而转录、翻译、蛋白质修饰和降解、脂肪酸合成、丙酮酸代谢、嘌呤核苷酸循环和信号转导途径等低表达。这些过程的差异表达可能是细胞对现场复杂环境的一种适应机制。

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