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【6h】

海水青鳉两种hepcidin基因铁过量和LPS刺激下表达模式差异研究

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摘要

缩略词中英文对照表

第1章 绪论

1.1 鱼类免疫系统

1.1.1 鱼类先天性免疫

1.1.2 鱼类获得性免疫

1.2 鱼类肝脏抗菌肽(hepcidin)

1.2.1 鱼类抗菌肽

1.2.2 抗菌肽hepcidin

1.2.3 Hepcidin的表达调控

1.3 NF-κB在鱼类先天性免疫中的作用

1.3.1 NF-κB家族

1.3.2 鱼类中受NF-κB调控的靶基因

1.3.3 NF-κB信号转导通路

1.3.4 鱼类NF-κB先天性免疫应答

1.4 研究目的意义和思路

1.4.1 研究目的意义

1.4.2 研究思路

第2章 海水青鳉两种抗菌肽hepcidin基因的表达特性分析

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 海水青鳉RNA的提取

2.2.2 Dot-blot检测OM-hep1和OM-hep2扩增片段特异性

2.2.3 OM-hep1和OM-hep2在不同发育阶段的表达特性

2.2.4 LPS刺激下OM-hep1和OM-hep2基因表达特性

2.2.5 OM-hep1和OM-hep2对铁过量的不同响应

2.3 讨论

2.3.1 OM-hep1和OM-hep2不同发育阶段表达特性

2.3.2 OM-hep1和OM-hep2对LPS刺激与铁过量的响应

2.4 小结

第3章 海水青鳉核转录因子NF-κB基因的克隆与表达特性

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 海水青鳉NF-κB(p65,NF-κB1,NF-κB2)基因的扩增和及序列分析

3.2.2 海水青鳉NF-κB基因(p65,NF-κB1,NF-κB2)的时空表达特性

3.2.3 LPS剌激下海水青鳉NF-κB基因(p65,NF-κB1,NF-κB2)及Myd88基因的表达特性

3.3 讨论

3.3.1 海水青鳉NF-κB家族基因序列分析

3.3.2 海水青鳉NF-κB家族三个亚单位的表达特性

3.4 小结

第4章 NF-κB与LPS介导的hepcidin两种基因表达模式关系

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 LPS介导的海水青鳉hepcidin两种变体与NF-κB的表达变化关系分析

4.2.2 NF-κB抑制剂对LPS调节的海水青鳉两种hepcidin变体表达变化的影响

4.3 小结

结论与展望

参考文献

在校参与的科研项目

致谢

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摘要

Hepcidin是一类具有铁调节功能的抗菌肽,在鱼类、两栖类和哺乳动物间高度保守。与人类不同,一些鱼类存在多种hepcidin基因变体。本实验室前期研究发现海水青鳉两种基因变体hepcidin1(OM-hep1)和hepcidin2(OM-hep2)在细菌感染时,其组织表达特性有差异,提示不同变体可能具有不同的生物学功能。而现有研究表明hepcidin基因在铁过量和免疫刺激下都会上调表达,同时在LPS刺激下,hepcidin的诱导表达通常经由核转录因子NF-κB的信号通路调控。为阐明OM-hep1和OM-hep2表达差异的生物学意义,本文探究了LPS刺激和铁过量下这两种变体的表达模式,并在克隆获得NF-κB的基础上,研究了两种不同基因变体表达模式的差异与NF-κB的关系,为进一步研究hepcidin在鱼类先天性免疫中的作用机制提供了有价值的数据。主要研究结果如下:
   1.用Real-timePCR(qPCR)定量分析了海水青鳉两种hepcidin变体(OM-hep1和OM-hep2)在不同发育阶段的表达特性。结果显示,OM-hep1和OM-hep2表达模式不同。OM-hep1在胚胎发育早期(受精后1d,4d)表达处于低水平,OM-hep2在整个胚胎发育过程表达维持低水平。在幼鱼发育阶段,虽然两者表达量均在16d达到最高值,但是OM-hep2在其他阶段表达水平普遍较低,OM-hep1则维持中等水平。在LPS刺激下,发现OM-hep2在肝脏和脾脏中被显著的诱导表达,在鳃中却下调表达;而OM-hep1在这三个组织器官中都显著下调表达;铁过量状态下,肝脏中OM-hep1表达水平明显上调,而在肠中没有显著变化,但OM-hep2表达水平在肝脏和肠中均明显下降。OM-hep1和OM-hep2的表达模式基本相反,且各自在LPS刺激或右旋糖酐铁注射后的表达变化不同,表明OM-hep1和OM-hep2可能具有不同的生物学功能。
   2.克隆获得了海水青鳉核转录因子NF-κB的三个亚单位(p65,NF-κB1,NF-κB2)部分基因序列,并分析了其表达特性。对NF-κB三个亚单位的序列分析表明NF-κB三个亚单位与多种鱼类同源性较高,其中与青鳉(Oryziaslatipes)的同源性最高,氨基酸相似度分别达87.64%,97.37%,95.27%。对其氨基酸结构预测分析发现,各自都拥有一个高度保守的Rel同源区RHD。用Real-timePCR定量分析表明,NF-κB三个亚单位在多个组织器官和不同发育阶段均有表达,但表达模式存在差异。在LPS刺激96h的时相中,肝脏、脾脏和鳃中的p65和NF-κB1基因均在刺激早期即显著上调,而NF-κB2的诱导表达相对滞后。
   3.LPS刺激下,OM-hep2与NF-κB的表达变化相一致,而OM-hep1与之相反,显示NF-κB可能参与OM-hep2的诱导表达。进一步用NF-κB抑制剂PDTC探讨了LPS介导的hepcidin表达模式差异与NF-κB基因表达的关系。结果显示,PDTC处理使OM-hep2表达被抑制,而OM-hep1的表达却被诱导,表明NF-κB参与了LPS介导的OM-hep2的转录调控,而OM-hep1的转录诱导与NF-κB的表达变化不一致。由此说明,NF-κB是hepcidin诱导表达的信号途径但不是唯一的途径,一些hepcidin的变体可能是通过其它信号途径调控表达的。

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