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低温脂肪酶生产菌筛选、基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

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第一章 绪论

1.1 脂肪酶概述

1.2 脂肪酶的应用

1.3 生物柴油的概述

1.4 本课题的研究意义、内容及创新点

第2章 脂肪酶生产菌的筛选及鉴定

2.1 实验材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第3章 高效脂肪酶生产菌生长特性及产酶优化

3.1 实验材料与仪器

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 脂肪酶大肠杆菌中的克隆、表达、分离纯化及酶学性质

4.1 实验材料与仪器

4.2沙雷氏菌脂肪酶原核表达质粒的构建及鉴定

4.3 脂肪酶基因lipA在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

4.4 脂肪酶的酶学性质

4.5 结果与分析

4.6 讨论

4.7 小结

第5章 高效脂肪酶催化合成生物柴油的初步研究

5.1 实验材料与仪器

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

5.5 小结

结论

参考文献

致谢

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摘要

脂肪酶(甘油酯水解酶,EC3.1.1.3)是一种特殊的甘油三酯水解酶,不仅能催化甘油三酯水解为甘油和脂肪酸,还能水解酯类,促进酯交换和酯合成。在药物合成、食品加工、洗涤剂和化妆品等行业领域都得到了广泛应用。
  采用罗丹明B平板透明圈法对不同来源的样品进行筛选,共获得55株脂肪酶生产菌株,其中菌株LHY-1具有生长速度快、在低温条件下产酶量高且稳定的特点。菌株LHY-1的16S rDNA序列与嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)序列相似性分别为99%、99%、98%、98%,根据生理生化分析,初步鉴定LHY-1为沙雷氏菌(Serratia sp.)。
  对沙雷氏菌(Serratia sp.)LHY-1的生长和产酶条件进行优化。菌株在前10h生长迅速,10h后进入稳定期,最佳产酶时间为16h。最适生长和最佳产酶的碳源和氮源分别是牛肉膏、酵母粉。在10℃-40℃生长良好,最佳产酶温度为20℃。在初始pH为4.0-10.0范围内生长良好,最佳产酶初始pH为7.0。该菌有着很高的耐盐度,盐度为9%时还生长,但最佳产酶的盐度为0。最适生长和最适产酶的装液量为30mL。
  对沙雷氏菌(Serratia sp.)LHY-1的脂肪酶基因克隆和表达,重组脂肪酶用Ni琼脂糖亲和柱纯化和SDS-PAGE检测,该重组脂肪酶蛋白分子量为36kDa。最适作用温度为30℃,脂肪酶在pH7.0-11.0和温度0-30℃的范围内稳定。Mg2+、Ca2+对酶活力有一定的促进作用。Co2+、Zn2+、SDS、PMSF、EDTA、EGTA对酶有部分抑制作用。
  菌株LHY-1的脂肪酶具有转酯能力,可催化大豆油合成生物柴油,其转酯率达到5.60%。

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