蕨类植物抱石莲的化学成分及抗氧化活性研究

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　　蕨类植物(Pteridophyte)，又名羊齿植物，是植物发展史上一个特殊的分支，它们在种质和代谢方面表现出多样性。在植物分类系统中，蕨类植物是介于苔藓植物和种子植物之间的一个类群，既是维管束植物又是孢子植物。蕨类植物在世界各地分布广泛，目前全世界约有蕨类植物1.2万种，我国约有2600多种，约占世界总数的1/5，是世界上蕨类植物种类较多的地区之一，其中有396余种可供药用。蕨类植物应用领域广泛，特别是在医药保健、食品、观赏、绿化、工业等方面，其经济利用价值受到人们的广泛关注。药用蕨类植物富含多种天然活性成分，其所具有的生物活性如抗菌、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等作用近年受到国内外学者的重视，具有极大的开发前景。文献研究表明，目前仍有一些种类的活性成分尚未被充分认识，且临床应用较少，为了更好地开发利用药用蕨类植物资源，对其进行化学成分及生物活性的研究具有十分重要的意义。
　　抱石莲(Lepidogrammitis drymoglossoides(Bak.) Ching)为水龙骨科(Polypodiaceae)骨牌蕨属（Lepidogrammitis）的蕨类植物，广泛分布于长江流域以南各省区。它为贵州苗族、侗族民间常用药物，常用于治疗毒蛇咬伤、跌打损伤、内外伤出血、疔疮疱疹等病症。以抱石莲为主药之一制成的制剂“复方蛇鳞草”及“复方蛇鳞草膏”，在临床中治疗毒蛇咬伤、甲沟炎等均取得了确切疗效。但目前关于抱石莲活性成分研究的报道较少，本课题组对抱石莲的化学成分及其生物活性进行了系统深入的研究，为抱石莲药材的质量控制及其药用植物资源的进一步开发利用提供依据。
　　方法:
　　本文对抱石莲的化学成分进行了系统的研究，并对其各提取部位及分离得到的单体化合物进行了体外抗氧化活性的筛选;运用HPLC法对分离得到的新化合物进行了含量测定。
　　抱石莲干燥全草21 Kg，以95％乙醇溶液加热回流提取2次，每次2小时，合并2次提取液，减压浓缩得浸膏(1.2 kg)。浸膏以适量蒸馏水分散，依次以等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压回收溶剂分别得石油醚(239.5 g)、氯仿(132.0 g)、乙酸乙酯(56.0 g)、正丁醇(122.5 g)四个提取部位。采用硅胶、SephadexLH-20、大孔吸附树脂等柱色谱及高效液相色谱技术对上述四个部位进行分离纯化，得到单体化合物。综合运用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)及核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY)等波谱学技术，结合化合物的理化性质对所得单体化合物的化学结构进行鉴定。
　　选用外源性自由基清除实验和体外细胞实验对抱石莲的各提取部位及所得单体化合物进行体外抗氧化活性的筛选。外源性自由基清除实验包括DPPH自由基清除实验、ABTS·+自由基清除实验、羟基自由基(·OH)清除实验;体外细胞实验采用永生系小鼠海马神经元HT22细胞，通过MTT法检测对谷氨酸(Glu)诱导的HT22细胞损伤的抑制活性来评价抱石莲部分单体化合物的抗氧化活性。
　　采用高效液相色谱(HPLC)法，对新化合物（filic-3-ene-28 oic acid，化合物1）进行含量测定。色谱条件如下:Agilent1260 Infinity高效液相色谱仪系统;DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm，5μm)色谱柱;流动相:乙腈(B)-0.5％磷酸水(A)(87∶13);流速:1.0 mL·min-1;进样量:20μL;检测波长:205 nm。
　　成果:
　　从抱石莲全草的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇部位共分离得到31个化合物，鉴定了其中29个成分，包括1个新化合物(1):filic-3-ene-28 oic acid(ZLD-1)、β-蜕皮甾酮(ZLD-2)、豆甾醇（ZLD-3）、β-谷甾醇(ZLD-4)、β-胡萝卜苷(ZLD-5)、里白醇（ZLD-6）、乌苏酸(ZLD-7)、大黄素甲醚(ZLD-8)、大黄素(ZLD-9)、伞形花内酯(ZLD-10)、滨蒿内酯(ZLD-11)、秦皮乙素(ZLD-12)、咖啡酸(ZLD-13)、咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(ZLD-14)、绿原酸(ZLD-15)、原儿茶酸(ZLD-16)、原儿茶醛(ZLD-17)、4-羟基苯甲酸甲酯(ZLD-18)、没食子酸(ZLD-19)、阿魏酸(ZLD-20)、(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（ZLD-21）、lyoniresinol(ZLD-22)、松脂醇二葡萄糖苷（ZLD-23）、正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷（ZLD-24）、二十四酸二十二酯(ZLD-25)、二十八烷酸二十六酯（ZLD-26）、正三十一烷酸乙酯(ZLD-27)、棕榈酸(ZLD-28)、硬脂酸(ZLD-29)。
　　对抱石莲的各提取部位和各单体化合物进行的外源性自由基清除实验中结果显示，抱石莲的乙醇总提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和氯仿部位对DPPH、ABTS·+和·OH自由基表现出明显的清除作用，且在一定浓度范围内呈量效关系;单体化合物中秦皮乙素(ZLD-12)、咖啡酸(ZLD-13)、咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(ZLD-14)、绿原酸(ZLD-15)、原儿茶酸(ZLD-16)、原儿茶醛(ZLD-17)、4-羟基苯甲酸甲酯(ZLD-18)、没食子酸(ZLD-19)、阿魏酸(ZLD-20)这9个化合物对DPPH、ABTS·+、·OH三种自由基有明显的清除效果，其中化合物绿原酸（ZLD-15）、原儿茶酸（ZLD-16）、原儿茶醛(ZLD-17)、没食子酸(ZLD-19)的IC50值小于阳性对照物Vc的。细胞实验筛选部分化合物的抗氧化活性结果显示化合物filic-3-ene-28 oicacid(ZLD-1)、豆甾醇（ZLD-3）、大黄素甲醚(ZLD-8)、咖啡酸(ZLD-13)、原儿茶醛（ZLD-17）在10μM浓度下有明显抑制谷氨酸(Glu)诱导的HT22细胞损伤的活性。
　　采用HPLC法对抱石莲中新化合物filic-3-ene-28 oic acid的含量进行了分析，结果表明，filic-3-ene-28 oic acid在37.5～290μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系，平均加样回收率为99.96％(RSD=1.61％，n=6)，平均含量为0.086 mg·g-1。
　　结论:
　　从抱石莲全草的95％乙醇提取物中共分离得到31个化合物，并通过理化性质结合波谱数据分析鉴定了其中29个化合物。它们分属于不同的结构类型，包括3个三萜、3个香豆素、2个蒽醌、4个甾体及苷、3个木脂素及苷和14个酚酸及脂肪酸类化合物，其中化合物1为新化合物，另有17个化合物(3、7、9～11、14～15、18～22、24～27、29)为首次从抱石莲中分离得到。研究结果表明抱石莲中主要化学成分类型为酚酸及甾体类化合物。
　　对抱石莲的各提取部位和各单体化合物进行体外抗氧化活性的筛选，结果表明，其抗氧化活性部位主要为乙酸乙酯和正丁醇部位，主要抗氧化作用的成分为酚酸类化合物，此外三萜及甾体类也表现出一定的抗氧化活性。
　　本文建立了抱石莲中filic-3-ene-28 oic acid的HPLC含量测定方法，经方法学考察和研究结果显示该方法简便、专属性强、分离效果好，为filic-3-ene-28 oic acid的继续研究奠定基础，为进一步建立对抱石莲药材的质量控制和开发利用抱石莲药用植物资源提供依据。
　　本文还对天然药物中酚酸类化合物的药理活性研究进展进行了综述，为酚酸类成分的研究和研发新药提供参考。

著录项

作者
张丽媛;
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作者单位

广州中医药大学;

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授予单位广州中医药大学;
学科中药学
授予学位博士
导师姓名高幼衡;
年度 2015
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正文语种中文
中图分类化学分析与鉴定;
关键词
蕨类植物; 抱石莲; 化学成分; 抗氧化活性; 含量测定;

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