黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性作用及其机理研究

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目的：
　　黄芩苷，是植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的主要活性成分，具有抗菌抗病毒、抗炎、利尿等生物活性，临床上常用于肝胆感染及肾盂肾炎等疾病的治疗。研究发现，黄芩苷具有良好的体外抗幽门螺杆菌活性，且对各种酶具有广泛的抑制作用，而其对脲酶的抑制作用及相关机制的研究鲜有报道。
　　因此，本文以黄芩苷为研究对象，旨在通过动力学研究、作用位点研究等试验探讨黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性的相关作用机理，为黄芩及其有效成分的进一步开发应用提供新的思路，也为脲酶抑制剂的开发提供基础研究资料。
　　方法：
　　1.采用berthelot比色法，建立黄芩苷对洋刀豆脲酶活性抑制作用的评价方法。
　　2.脲酶活性抑制试验：通过孵育时间考察、半数抑制浓度实验，探讨黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性的作用效力。
　　3.脲酶抑制类型试验：运用Lineweaver-Burk plot双倒数作图法求得黄芩苷存在的情况下洋刀豆脲酶酶促反应的动力学参数KM与vmax，并通过分析两者的变化特点判断黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性的作用类型。
　　4.脲酶动力学研究试验：采用反应进度曲线试验，验证黄芩苷抑制洋刀豆脲酶的动力学作用类型，并求得两者之间相互作用的抑制常数。
　　5.脲酶抑制位点分析试验：通过巯基保护试验，洋刀豆脲酶与黄芩苷、含巯基化合物三者之间的加入顺序、孵育时间考察试验，洋刀豆脲酶的再活化试验，阐明黄芩苷对洋刀豆脲酶的抑制作用机理。
　　6.脲酶与抑制剂分子对接研究：以Auto-Dock version4.0为分子对接的运行软件，分析黄芩苷与洋刀豆脲酶中活性部位的相互作用情况。
　　结果：
　　1.对洋刀豆脲酶活性抑制作用研究
　　（1）黄芩苷与洋刀豆脲酶进行保温孵育，残余酶活性与孵育时间呈负相关。黄芩苷与洋刀豆脲酶相接触，两者在10 min内快速达到游离脲酶、游离黄芩苷及脲酶-黄芩苷复合物三者平衡状态，故孵育时间对黄芩苷的抑制作用影响不明显。
　　（2）黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性的半数抑制浓度（ IC50）为2.74±0.51 mM（R2=0.97），与乙酰氧肟酸AHA（IC50=0.107±0.16 mM）相比较，其抑制效力虽不及AHA强，但半数抑制浓度仍达至毫摩尔级别。
　　2.对洋刀豆脲酶抑制类型研究
　　在没有抑制剂黄芩苷的存在下，洋刀豆脲酶酶促反应的米氏常数KM为2.52±0.12 mM，最大反应速度vmax为3.64±0.11 mM/min。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法，得到黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性的动力学参数的变化特点是：KM不变，vmax降低，初步推断黄芩苷是非竞争性抑制类型的脲酶抑制剂。
　　3.对洋刀豆脲酶动力学研究
　　根据黄芩苷与洋刀豆脲酶的反应进度曲线，洋刀豆脲酶与黄芩苷先以抑制常数Ki=3.89×10-3 mM快速形成脲酶-黄芩苷复合物 EI，随后以抑制常数 Ki*=1.47×10-4 mM缓慢异构化为脲酶-黄芩苷复合物EI*。结合孵育时间考察、抑制类型试验相应的结果分析，确定黄芩苷属于缓慢结合型（slow-binding）脲酶抑制剂，且在与洋刀豆脲酶反应过程中呈现浓度依赖性的特点。
　　4.对洋刀豆脲酶抑制位点研究
　　（1）黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性的作用位点是巯基，黄芩苷与含巯基化合物中巯基的亲和力比与洋刀豆脲酶中巯基的亲和力大。
　　（2）黄芩苷、含巯基化合物、洋刀豆脲酶三者相互作用时，孵育时间与加入顺序对洋刀豆脲酶活性的影响均不显著。
　　（3）黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性具有可逆性，加入DTT可逆转其对洋刀豆脲酶活性的抑制作用，使洋刀豆脲酶恢复活性。
　　5.洋刀豆脲酶与黄芩苷分子对接研究
　　黄芩苷通过与洋刀豆脲酶flap区域上的残基，特别是Cys-592形成了较强的氢键作用，从而使flap构象保持张开的状态，降低了酶的活性。
　　结论：
　　通过系统地研究黄芩苷抑制洋刀豆脲酶活性的动力学及作用机理，表明黄芩苷具有一定的抑制洋刀豆脲酶活性的作用，属于竞争性-缓慢结合型脲酶抑制剂，主要作用于洋刀豆脲酶中巯基活性部位，从而起到抑制洋刀豆脲酶活性的作用。分子对接模拟结果验证了洋刀豆脲酶的巯基活性位点与黄芩苷致脲酶失活直接相关。因此，黄芩苷可作为潜在的脲酶抑制剂应用于各个领域。

著录项

作者
谭丽容;
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作者单位

广州中医药大学;

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授予单位广州中医药大学;
学科中药学
授予学位硕士
导师姓名林吉;
年度 2013
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类有效成分的分离与提取;
关键词
黄芩苷; 活性成分; 抗菌抗病毒; 脲酶抑制剂; 洋刀豆脲酶;

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