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基于HCR的miRNAs液相芯片检测体系的建立及S-poly(T)PCR筛选非小细胞肺癌miRNAs标志物的研究

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第一章前言

1 miRNAs与肺癌

1.1 miRNAs与肺癌发生发展的关系

1.2 miRNAs与肺癌的诊断及预后

2 循环miRNAs检测在肺癌早期诊断中的价值

2.1 循环 miRNAs在肺癌早期诊断中的优势

2.2 肺癌特异的循环miRNAs筛查

3 miRNAs检测技术

3.1 S-Poly(T)法在miRNAs检测中的应用

3.2 Luminex液相芯片技术

4 基于杂交链反应（HCR）的信号放大技术

4.1 HCR原理

4.2 HCR与磁珠分析

第二章 S-poly(T) PCR筛选非小细胞肺癌miRNAs标志物的研究

1. 引言

2. 材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3. 结果

3.1. 第一步筛选结果

3.2. 第二步筛选结果

3.3. 单样本验证预实验结果

3.4. 血浆miRNAs在肺腺癌诊断中的价值

3.5. 血浆miRNAs在肺鳞癌诊断中的价值

4. 讨论

第三章 基于HCR的液相芯片检测miRNAs方法的建立

1 引言

2 材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3 结果

3.1基于HCR的miRNAs液相芯片检测原理

3.2电泳验证

3.3反应条件的优化

3.4方法学评价

4 讨论

论文小结

参考文献

综述：血液及痰液miRNAs检测在肺癌早期筛查和诊断中的价值

在校期间发表论文

致谢

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摘要

目的：利用S-poly(T) PCR检测技术，对非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆miRNAs分阶段筛选，旨在获得对NSCLC具有早期诊断价值的miRNAs组合，为NSCLC早期诊断提供新的生物学标记。
　　方法：利用S-poly(T) PCR检测技术，筛选280例NSCLC患者和277例健康人血浆中特异的miRNAs。第一步，我们将126例Ⅰ期NSCLC患者血浆、154例Ⅱ~Ⅳ期NSCLC患者血浆、277例正常人血浆，各混合为一份，检测486个miRNAs的表达，筛选出在Ⅰ期或Ⅱ~Ⅳ期NSCLC患者血浆中有差异表达的126个miRNAs。第二步，将92例腺癌Ⅰ期患者血浆、108例腺癌Ⅱ~Ⅳ期患者血浆，以及34例鳞癌Ⅰ期患者血浆、46例鳞癌Ⅱ~Ⅳ期患者血浆和277例正常人血浆，各混合为一份。对第一阶段筛选出的126种miRNA进行检测，获得40个腺癌差异表达的miRNAs和42个鳞癌差异表达的miRNAs。第三步，预实验筛选出10个腺癌特异的miRNAs和9个鳞癌特异的miRNAs后，利用上述指标进一步对280例NSCLC患者血浆和277例健康人血浆做单样本验证，并利用Logistic回归分析，获得NSCLC的miRNAs早期诊断标准，同时对入选诊断标准的miRNAs的表达情况与患者临床分期进行相关性分析。
　　结果：通过三步筛选，并对筛选出的10个腺癌特异的miRNAs和9个鳞癌特异的miRNAs进行单样本验证，利用Logistic回归分析，miR-451a、miR-152-3p、miR-183-5p、miR-144-3p入选腺癌诊断标准（Cma）；miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p入选鳞癌诊断标准（Cms）。受试者工作曲线（ROC）分析显示，腺癌诊断标准中的4个miRNAs的ROC曲线下面积（AUC）为0.592-0.803，灵敏度为35.2-60.2％，特异度为82.2-93.3%；而由miR-451a、miR-152-3p、miR-183-5p、miR-144-3p组合的Cma检测腺癌的AUC为0.935，灵敏度为79.6%，特异度为97.8%，诊断价值比任一单基因高。另一方面，miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p诊断鳞癌的AUC为0.515-0.870，灵敏度为41.8-74.7%，特异度为72.2-96.7%；而由这3个miRNAs组成的鳞癌诊断标准Cms对鳞癌的诊断价值可提高至AUC0.981，灵敏度92.4%，特异度91.1%。相关性分析显示Cma及Cms均与腺癌分期正相关。
　　结论：miR-451a、miR-152-3p、miR-183-5p、miR-144-3p联合诊断腺癌。miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p联合诊断鳞癌，是肺癌早期诊断中具有潜在诊断价值的新的非侵入性生物标志物。
　　目的：由于无细胞体液临床样本中miRNAs含量较低，我们建立了基于链杂交反应（HCR）信号放大体系的miRNAs液相芯片检测方法，以解决液相芯片miRNAs检出限（LOD）较高的问题，为临床样本多重miRNAs检测奠定基础。
　　方法：我们设计了一种新型的发夹结构探针（探针M），它包括一段微球连接序列、一段与目标miRNA互补的序列、以及一段可引发HCR反应的序列。探针M变性退火后形成茎-环二级结构，并首先在体系中被微球被捉。当目标miRNAs存在时，体系中相应的探针M即打开其发夹结构，释放HCR引发链，从而引发两个生物素标记的茎环结构DNA单体（探针1及探针2）发生一系列的链杂交反应。随着反应进行，生物素被探针带到微球表面。当链霉素亲和素-藻红蛋白（SA-PE）被加入体系后，各微球表面即可富集到大量的荧光信号，从而实现信号放大。检测时，Luminex仪器可同时识别微球的颜色和荧光强度，从而对样本中的miRNAs进行定性及定量分析。
　　结果：研究结果表明，HCR信号放大策略的加入使let-7a的定量限降低到了0.1pM，灵敏度是传统液相芯片的10倍。另外，本方法还能以较高的特异性区分不同miRNAs的序列差异，并可成功运用于血浆样本的分析中。尽管如此，血浆中的复杂成分对荧光强度仍产生了轻微的抑制作用。此外，通过同时定量分析miR-21和let-7a，本方法表现出较好的多重定量能力。
　　结论：通过HCR信号放大体系，液相芯片对let-7a的定量限达到0.1pM级别，miRNAs的检测灵敏度提高10倍。

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