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β2肾上腺素受体激动剂克伦特罗对睾丸间质细胞与脂肪细胞共培养体系中睾丸间质细胞INSL3及3β-HSD的表达效应

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摘要

目的：
　　1.应用3T3-L1脂肪细胞体外培养体系，探讨克伦特罗（clenbuterol，CLB），莱克多巴胺（ractopamine，RAC）和齐帕特罗（zilpaterol，ZIL）对脂肪细胞过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators activated receptorγ，PPARγ）及脂联素（adiponectin，ADP）表达的影响及差异，阐明CLB，RAC，ZIL引起脂肪细胞内分泌紊乱的分子机制，以及三者对脂肪内分泌紊乱相关性生殖疾病潜在的影响。
　　2.建立脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养模型，探讨成熟脂肪细胞对睾丸间质细胞胰岛素样因子（Insulin-like factor。INSL3）及3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD）的表达效应，有助于阐明肥胖诱导男性不育症的分子机制。
　　3.建立脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养模型，探讨CLB对共培养体系中睾丸间质细胞INSL3及3β-HSD表达的影响，阐明CLB在脂肪内分泌紊乱相关性男性生殖疾病中可能介导的环节。
　　材料与方法：
　　1.材料
　　1.13T3-L1脂肪细胞
　　3T3-L1前脂肪细胞株购自于中国科学院上海细胞库，定向诱导为3T3-L1成熟脂肪细胞后进行实验。
　　1.2 TM3睾丸间质细胞
　　TM3睾丸间质细胞由暨南大学禹艳红老师惠赠，培养传代后可进行实验。
　　2.实验分组及给药
　　2.13T3-L1脂肪细胞分组及给药
　　本项实验添加不同剂量的药物培养12h，24h后分别收集细胞，进行细胞活性与PPARγ及ADP表达水平的检测。本项实验分组见表1。(此处图表省略）
　　2.2共培养体系分组及给药
　　将睾丸间质细胞分别与成熟脂肪细胞，添加5μM CLB处理的成熟脂肪细胞共培养48小时，分别标记为脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组，CLB处理脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组；另添加5μM CLB处理睾丸间质细胞单独培养，标记为CLB处理睾丸间质细胞实验组；将单独培养的睾丸间质细胞设为对照组。
　　3.实验方法
　　3.13T3-L1前脂肪细胞诱导及鉴定
　　3T3-L1前脂肪细胞用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养液在37℃，5%CO2条件培养。待细胞贴壁，生长至接触抑制后2天进行成脂诱导分化，更换含有0.5mM IBMX、10μg/ml胰岛素和1μM地塞米松的诱导剂及10%FBS的DMEM高糖培养液。2天后，更换只含10μg/ml胰岛素及10%FBS的培养液继续培养，每2天换液1次。8-10天后，90%的细胞内出现脂滴，可用于后续实验。油红O染色鉴定成熟脂肪细胞。
　　3.2 TM3睾丸间质细胞的培养
　　TM3睾丸间质细胞用含10%马血清的DMEM/F12培养液，在37℃，5%CO2培养箱培养，每2天换液1次，直至细胞融合达80%以上，可进行传代。
　　3.3共培养体系的建立
　　采用Transwell系统进行3T3-L1脂肪细胞和TM3睾丸间质细胞共培养。3T3-L1脂肪细胞种入6孔培养板，经诱导后，在Transwell小室种入TM3睾丸间质细胞。在37℃，5%CO2培养箱中培养48小时。
　　3.43T3-L1脂肪细胞活性检测
　　MTT分别检测不同剂量CLB，RAC，ZIL对3T3-L1脂肪细胞活性的影响。
　　3.5脂肪因子PPARγ及ADP，睾丸间质细胞INSL3及3β-HSD的表达
　　RT-PCR和Western blot检测脂肪因子PPARγ、ADP，睾丸间质细胞INSL3、3β-HSD表达水平的变化。
　　4.统计学方法
　　数据以平均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS21.0统计学软件进行分析。采用单因素方差分析（ANOVA），有统计学意义则用Tukey法作组间均数的两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.3T3-L1脂肪细胞诱导及鉴定
　　3T3-L1前脂肪细胞生长接触抑制后，经诱导8-10天，3T3-L1前脂肪细胞可分化为成熟脂肪细胞。并经油红O染色鉴定，大约90%的3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。
　　2. CLB，ZIL，RAC对3T3-L1脂肪细胞活性的影响及差异
　　与对照组相比，CLB，RAC，ZIL分别处理12h和24h后各剂量组细胞活性均呈下降趋势，剂量越大，活性影响越大，差异显著（P<0.05）。
　　培养12h，细胞活性：B组0.05）；C组0.05），C组0.05）。培养24h。B组0.05）；C组　　3. CLB，ZIL，RAC对3T3-L1脂肪细胞PPARγ及ADP表达的影响及差异
　　CLB，RAC，ZIL对PPARγ、ADP的表达影响基本呈一致性。CLB，RAC。ZIL均下调PPARγ、ADP mRNA和蛋白的表达水平，且表达水平从高到低的顺序为：低剂量组，中剂量组，高剂量组（P<0.05）。
　　培养12h，PPARγ的表达水平：B组0.05）；C组　　培养12h，ADP的表达水平：B组0.05）；D组0.05），B1组0.05）；C组0.05）。
　　4.脂肪细胞共培养及CLB对睾丸间质细胞INSL3及3β-HSD表达的影响
　　与睾丸间质细胞单独培养对照组对比，CLB处理睾丸间质细胞组INSL3表达下降，但无显著差异（P>0.05），脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组INSL3表达下降（P<0.05）；CLB处理脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组INSL3下降程度更大（P<0.05）。与睾丸间质细胞单独培养对照组对比，CLB处理睾丸间质细胞组3β-HSD表达升高，但无显著差异（P>0.05）；脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组3β-HSD表达下降（P<0.05）；CLB处理脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组3β-HSD下降程度更大（P<0.05）。
　　结论：
　　1. CLB，ZIL，RAC按影响程度从大至小依次降低脂肪细胞活性，下调PPARγ、ADP mRNA和蛋白的表达水平，并呈剂量依赖性，提示 CLB，ZIL。RAC影响PPARγ和ADP的合成，可导致脂肪细胞内分泌紊乱，从而可能引起脂肪内分泌紊乱相关性生殖活动。
　　2.β2AR激动剂对脂肪细胞内分泌功能的效应与激动剂种类相关，CLB，ZIL。RAC这3种激动剂对脂肪细胞产生效应不同，其中CLB影响最大，ZIL次之。RAC影响较小。
　　3.与脂肪细胞共培养下，睾丸间质细胞INSL3与3β-HSD的表达下降可能是肥胖引发男性生殖疾病的重要机制；CLB与脂肪细胞共同作用下，3β-HSD与INSL3表达下降程度更大，CLB相关的脂肪细胞内分泌紊乱可能引起男性生殖系统异常。

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