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【6h】

SHH信号通路在顺铂损伤后斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生过程中的表达及意义

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前言

第一部分 顺铂损伤后斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生情况

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 结论

5 讨论

第二部分 SHH信号通路在顺铂损伤后斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生过程中的表达

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 结论

5 讨论

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摘要

背景:耳毒性是顺铂临床应用中的一个严重毒副作用，目前缺乏有效药物用于顺铂耳毒性的预防及治疗。既往研究认为成年哺乳动物包括人类耳蜗毛细胞缺乏自发再生能力，近年来通过外源性基因的诱导、促分化作用使成年鼠类内耳毛细胞再生成为可能，这也为人类内耳毛细胞再生带来了希望。因此，促进损伤后毛细胞再生也许能成为解决顺铂耳毒性这一难题的另一途径。毛细胞再生是一个多因子参与调控的复杂过程，Math1基因、Notch信号通路、bFGF等都被证实能调控毛细胞的再生。Sonic hedgehog(Shh)信号通路在哺乳动物耳蜗发育及毛细胞形成中，起着非常重要的调控作用，尽管目前有大量关于Shh在内耳发育过程中作用的研究，但是其在毛细胞再生过程中的作用却不十分清楚。斑马鱼是新兴脊椎类模式生物，其基因与人类基因相似度约87％，斑马鱼幼鱼侧线毛细胞已经是一个比较成熟的毛细胞再生研究模型，侧线毛细胞与斑马鱼内耳毛细胞在发育和分化立体模式、结构及功能调控机制上极为相似，且位于体表，易于观察，在损伤后能自发再生。既往动物实验研究表明氨基糖苷类抗生素引起的耳毒性机制与顺铂有所区别，与新霉素对比，顺铂能在一定程度上抑制毛细胞再生，但是顺铂抑制毛细胞再生的机制、此过程涉及因子以及顺铂是否影响毛细胞再生调控基因的启动等目前仍然不清楚，所以氨基糖苷类药物耳毒性模型不能代替顺铂耳毒性模型用于顺铂损伤后毛细胞再生的研究。鉴于此，采用顺铂建立斑马鱼幼鱼侧线毛细胞损伤及再生模型，并研究Shh信号通路在顺铂损伤后斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生过程中的表达及意义。
　　目的:建立斑马鱼幼鱼侧线毛细胞顺铂损伤及再生模型;探究Shh信号通路在顺铂损伤后斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生过程中的表达及作用，为探讨顺铂损伤后人类听觉毛细胞再生提供借鉴。
　　方法:本实验采用50umol/L浓度的顺铂溶液处理受精后5天(5dpf)斑马鱼幼鱼24h，撤药后观察侧线毛细胞损伤及再生情况。为了探究Shh信号通路在顺铂损伤后斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生过程的表达及作用，采用斑马鱼整体原位杂交技术检测Shh基因及下游重要转录因子gli1在侧线毛细胞再生过程的表达情况，并且采用Shh信号通路特异性抑制剂Cyclopamine抑制Shh信号通路后对比侧线毛细胞再生情况。
　　结果:(1)对照组斑马鱼幼鱼侧线SO1、SO2、O1、OC1这四个神经丘毛细胞平均数目为9.675±0.64603;移除顺铂后0h，毛细胞平均数目为0.2222±0.26352，而在移除顺铂后6h、12h、24h及48h，毛细胞平均数目分别为0.6944±0.30046、2.0750±0.55340、4.1818±0.58192、6.5250±0.50621。各时段毛细胞恢复数占对照组毛细胞数百分比为7.18％、21.45％、43.22％、67.44％。(2)Shh基因和Gli1基因在对照组斑马鱼幼鱼侧线神经丘都有表达;在移除顺铂后6h，与对照组相比较，Shh基因表达量显著下降，而随着时间的推移，Shh基因表达量逐渐增高，恢复甚至超过对照组;Gli1基因的分布及表达情况类似于Shh基因。(3)Cyclopamine溶液处理组斑马鱼侧线SO1、SO2、O1、OC1这四个神经丘毛细胞平均数目为2.2955±0.49772，而未采用抑制剂组毛细胞平均数目为3.8000±0.94868，两者差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:(1)顺铂可以有效破坏斑马鱼幼鱼侧线毛细胞，而侧线毛细胞在损伤后可以自发再生，采用斑马鱼幼鱼建立顺铂毛细胞损伤及再生模型可行。(2)Shh信号通路参与了斑马鱼幼鱼侧线神经丘的正常发育及功能维持。(3)Shh信号通路在顺铂损伤后斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生过程中重新被激活，参与侧线毛细胞再生的过程;抑制Shh信号通路的活性可以在一定程度上抑制侧线毛细胞的再生，进一步说明了Shh信号通路在顺铂损伤后斑马鱼幼鱼侧线毛细胞再生过程中发挥了正向调控的作用。

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