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PI3K/Akt/FoxO3a信号通路和PKA/CREB信号通路在氟西汀保护皮质酮诱导PC12细胞损伤中的作用

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摘要

前言

第一部分 氟西汀对皮质酮诱导PCI2细胞损伤的保护作用及可能机制

引言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验设计

四、统计学处理

五、实验结果

六、小结

第二部分 PI3K／Akt／FoxO3a通路和PKA／CREB通路在氟西汀保护皮质酮诱导PC12细胞损伤中的作用

引言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验设计

四、统计学处理

五、实验结果

六、小结

第三部分 氟西汀对FoxO3a及CREB下游靶基因的影响

引言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验设计

四、统计学方法

五、实验结果

五、小结

讨论

结论

展望

参考文献

中英文缩略词表

攻读学位期间发表的论文

致谢

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摘要

许多研究表明，抗抑郁药能通过改变相关蛋白的磷酸化状态和相关基因的表达水平，从而促进海马神经元细胞的增殖、成熟以及数目增加，表现出神经保护作用。PI3K/Akt/FoxO3a信号通路，是细胞内重要的信号转导通路之一，主要参与调节细胞的生长、分化、代谢、凋亡等过程，通过影响下游多种靶基因、靶蛋白的活化状态，促进细胞存活，抑制细胞凋亡，发挥脑保护作用。在精神疾病中的作用已引起广泛重视。而PKA/CREB/BDNF信号通路，也早已被证明参与抑郁症的治疗及神经保护过程当中，PKA激活CREB磷酸化，进一步激活其下游信号分子BDNF。BDNF与其受体TrkB结合，激活细胞内信号级联反应，促进神经发生、突触可塑性、神经元损伤后修复。
　　目的:
　　由于PC12细胞具有非常典型的神经元细胞的特征，而且高度表达肾上腺糖皮质激素受体，已广泛用于神经系统的研究当中。本课题以PC12细胞为研究对象，利用抑郁症发生时HPA轴活化导致海马神经元损伤的特点，采用皮质酮诱导抑郁症的细胞模型，用经典的抗抑郁药氟西汀考察PI3K/Akt/FoxO3a是否参与这一疾病，研究在抑郁症发生过程中该信号通路的作用，并探讨该通路与PKA/CREB/BDNF信号通路的关系。
　　方法:
　　1、以PC12细胞为研究对象，建立由皮质酮诱导的损伤模型，观察氟西汀对细胞损伤模型的保护作用。
　　首先，采用MTT法检测了不同浓度的皮质酮(0-1000μM)对PC12细胞的损伤作用，根据不同浓度皮质酮对细胞造成的损伤程度，选择能够杀死60-70％细胞的皮质酮浓度用于后续实验。此外，还使用RU486（肾上腺糖皮质激素受体拮抗剂），对抗皮质酮的损伤作用，由此判断皮质酮带来的细胞损伤是否由肾上腺糖皮质激素受体介导。
　　接着，将细胞分为正常组、模型组、不同浓度的氟西汀(0.1μM-100μM)给药组，采用MTT法检测了氟西汀对皮质酮诱导PC12细胞损伤是否具有保护作用，并确定了后续实验中氟西汀使用的浓度;采用Hoechst染色，在荧光显微镜下观察细胞形态，统计各组中细胞的凋亡数目，从而进一步探究氟西汀对皮质酮诱导PC12细胞损伤是否具有保护作用。
　　2、考察PI3K/Akt与PKA是否参与氟西汀对抗作用。
　　采用通路阻断剂预处理(PI3K的抑制剂LY294002，50μM，40 min; Akt的抑制剂KRX-0401，45μM，40 min; PKA的抑制剂H89，10μM，40 min)，观察皮质酮对PC12细胞的损伤作用，以及氟西汀对细胞损伤模型的保护作用是否会被削弱，采用MTT法检测细胞存活率。
　　3、考察氟西汀对Akt/FoxO3a及CREB活化的影响，以及氟西汀影响FoxO3a及CREB磷酸化的信号通路。
　　首先，采用不同浓度氟西汀(1μM、3μM、10μM)分别处理细胞不同时间点(5 min、10 min、20 min、40 min)，通过Western Blot检测FoxO3a、 Akt、CREB等蛋白磷酸化水平，以获得在基础条件下，氟西汀对这些蛋白表达及磷酸化影响的时效及量效关系，探究氟西汀如何影响Akt/FoxO3a及CREB的活化。
　　接着，采用通路阻断剂预处理(PI3K的抑制剂LY294002，50μM，40 min;Akt的抑制剂KRX-0401，45μM，40 min; PKA的抑制剂H89，10μM，40 min)，通过Western Blot检测FoxO3a、Akt、CREB等蛋白磷酸化水平。
　　4、考察氟西汀在皮质酮存在的条件下，对FoxO3a及CREB磷酸化的影响;以及氟西汀促进FoxO3a及CREB磷酸化影响的信号通路。
　　首先，将皮质酮(500μM)与氟西汀(1μM、3μM、10μM)共同处理细胞20 min，通过Western Blot检测FoxO3a、Akt、CREB等蛋白磷酸化水平，以获得在造模情形下，氟西汀对这些蛋白表达及磷酸化的影响。
　　接着，采用通路阻断剂预处理(PI3K的抑制剂LY294002，50μM，40 min;Akt的抑制剂KRX-0401，45μM，40 min; PKA的抑制剂H89，10μM，40 min)，通过Western Blot检测FoxO3a、Akt、CREB等蛋白磷酸化水平。
　　5、考察氟西汀对FoxO3a及CREB下游靶基因的影响。
　　同样采用通路阻断剂预处理(PI3K的抑制剂 LY294002，50μM，40 min;PKA的抑制剂H89，10μM，40 min)，将皮质酮(500μM)与氟西汀(1μM、3μM、10μM)共同处理细胞24 h，采用RT-PCR方法观察皮质酮与氟西汀共同处理细胞时，FoxO3a下游靶基因Bim、Bax、Puma及BDNF的mRNA水平变化。
　　结果:
　　1、氟西汀则能剂量依赖性地对抗皮质酮对PC12细胞的损伤。
　　(1) MTT细胞活性测试的结果显示，皮质酮浓度高于250μM时能够对PC12细胞造成显著的损伤(P＜0.05)。由于500μM浓度的皮质酮能够更稳定的杀死60-70％的细胞，我们选择该浓度进行后续实验。
　　(2) Hoechst染色观察皮质酮对PC12细胞凋亡的影响，细胞体积皱缩、染色质凝聚、细胞核显发亮荧光、细胞膜碎裂的细胞视作凋亡细胞。与正常组比，模型组细胞多核染色质浓缩密集、形成新月状亮光团块、多见破裂细胞碎片等细胞凋亡及死亡细胞的形态学表现。而氟西汀浓度高于3μM时能剂量依赖性地对抗皮质酮的损伤(P＜0.05)，且浓度在10μM时氟西汀对抗皮质酮损伤的作用最强(P＜0.05)，该浓度下的氟西汀能明显减少凋亡以及坏死细胞的数目(P＜0.05)。
　　(3)而当肾上腺糖皮质激素受体拮抗剂RU486浓度高于1μM时能够明显对抗皮质酮所致的细胞损伤(P＜0.05)，证明了皮质酮作用由肾上腺糖皮质激素受体介导。
　　2、PI3K/Akt与PKA参与了氟西汀对抗作用。
　　MTT结果显示，500μM的皮质酮对细胞产生损伤作用，而氟西汀处理细胞能够对抗这一损伤(P＜0.001)。采用PI3K的抑制剂LY294002、Akt的抑制剂KRX-0401以及PKA的抑制剂H89进行预处理，氟西汀对细胞损伤模型的保护作用被抑制(P＜0.05)，证明PI3K/Akt与PKA参与了氟西汀对抗作用。
　　3、氟西汀促进Akt/FoxO3a及CREB的活化，且氟西汀影响FoxO3a及CREB磷酸化的信号通路分别是PI3K/Akt/FoxO3a与PKA/CREB。
　　(1) Western Blot结果显示，氟西汀在基础条件下能够剂量依赖性(1μM、3μM、10μM)的增加Akt、FoxO3a及CREB磷酸化（P＜0.001);选择10μM浓度的氟西汀按5-40 min处理细胞，通过Western Blot方法检测，获得了氟西汀能够时间依赖性(P＜0.001)的增加FoxO3a、Akt、CREB等蛋白磷酸化水平的证据。
　　(2)进一步探究氟西汀如何影响Akt/FoxO3a及CREB的活化。通过WesternBlot方法检测，PI3K的抑制剂LY294002、Akt的抑制剂KRX-0401以及PKA的抑制剂H89，分别能使FoxO3a、Akt与CREB等蛋白磷酸化水平显著降低（P＜0.001），证明氟西汀分别是通过PI3K/Akt/FoxO3a与PKA/CREB影响FoxO3a及CREB的活化。
　　4、氟西汀在皮质酮存在的条件下同样能够促进FoxO3a及CREB磷酸化，且氟西汀对FoxO3a及CREB磷酸化影响的信号通路分别是PI3K/Akt/FoxO3a与PKA/CREB。
　　(1) Western Blot结果显示，皮质酮(500μM)显著降低FoxO3a、Akt、CREB等蛋白磷酸化水平(P＜0.001)，而氟西汀(1μM、3μM、10μM)能够显著对抗该三种蛋白磷酸化水平的下降(P＜0.001)。
　　5、氟西汀通过下调Bim、Bax、Puma，上调BDNF的mRNA水平，影响FoxO3a及CREB下游靶基因。
　　RT-PCR结果显示，皮质酮对细胞产生损伤作用，Bim、Bax、Puma的mRNA水平显著升高(P＜0.001)，BDNF的mRNA水平显著下降(P＜0.001);而氟西汀处理细胞能够逆转皮质酮的上述作用（P＜0.001）。采用PI3K的抑制剂LY294002、Akt的抑制剂KRX-0401以及PKA的抑制剂H89进行预处理，氟西汀对这些基因的作用被削弱(P＜0.001)。
　　结论:
　　1、皮质酮剂量依赖性的诱导PC12细胞损伤，建立了稳定的细胞损伤模型。而氟西汀给药组细胞明显逆转这一损伤，细胞凋亡、甚至死亡的情况得到缓解。
　　2、皮质酮使pFoxO3a、pAkt、pCREB降低，而氟西汀给药后逆转这种作用，升高磷酸化水平，发挥促存活作用。
　　3、采用PI3K、Akt、H89的阻断剂预处理，氟西汀对这三种蛋白磷酸化的作用被削弱，说明氟西汀分别通过PI3K/Akt/FoxO3a及PKA/CREB/BDNF这两条通路来发挥作用，也提示FoxO3a转录因子可能是抑郁症发生发展过程中的一个重要分子。

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