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非B细胞来源Igκ保守序列特异性抗体应用的初步研究与ECDI交联的人脾淋巴细胞诱导供者特异性耐受的实验体系初步建立

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摘要

第一部分 非B细胞来源IgK保守序列特异性抗体应用的初步研究

前言

第一章 双单抗夹心ELISA检测血清VK4-1-JK3型Ig体系的建立与应用

1．1 材料和方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 总结

第二部分 ECDI交联的人脾淋巴细胞诱导供者特异性耐受的体系初步建立

前言

第一章 ECDI交联人脾淋巴细胞诱导供者特异性耐受实验体系初步建立

1．1 主要材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 总结

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摘要

本文主要从以下几个部分进行论述：
　　第一部分 非B细胞来源Igκ保守序列特异性抗体应用的初步研究
　　传统免疫球蛋白(Ig)是由B淋巴细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所分泌的重要的免疫分子，两种表现形式分别为分泌型与膜型。分泌型Ig主要是以抗体形式存在体液中，特异性结合相应的抗原发挥多种免疫功能，因此，在特异性体液免疫中发挥重要作用;膜型Ig是以B细胞抗原受体(BCR)的形式存在B细胞表面，对于细胞活化、抗原识别、分化及程序性细胞死亡中起重要作用。
　　目前的免疫学理论认为在正常的机体内，免疫球蛋白基因仅在B淋巴细胞发育过程中选择性进行重组，而该基因在其它体细胞中处于胚系状态，是B淋巴细胞的特征性产物。但是，关于非B淋巴细胞产生Ig分子的现象逐渐被国内外学者认可。2003年北京大学邱晓彦教授首次发现上皮来源肿瘤细胞（非淋巴性肿瘤）及部分增生正常上皮细胞可产生Ig。邱晓彦教授课题组进一步研究发现该Ig可能具有生长因子样活性，对肿瘤生长以及增殖有重要的作用，并且发现癌细胞产生的Ig分子基因表达调控机制以及结构与来源B淋巴细胞的Ig典型特征完全不同。
　　B淋巴细胞可产生多种不同特异性的Ig来应对多种抗原。理论认为，Ig是以可变区（V区）结合相应抗原，因而V区的多样性是保证应对、识别或结合理论所有抗原的基础。免疫球蛋白Ig由胚系基因编码，而基因片段需要基因重排成为功能性编码基因。Ig可变区的多样性来源于B淋巴细胞中基因组发生重排组合以及连接与抗原刺激后诱发的B淋巴细胞高频突变。传统免疫学理论认为，Ig只在B淋巴细胞发育过程中选择性重排。邱晓彦教授课题组研究发现乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、胃癌、鼻咽癌、胰腺癌等上皮来源肿瘤细胞及部分正常上皮细胞内Ig存在功能性基因重排。不同类型的肿瘤细胞表达完全相同的可变区序列，同一个体以及不同个体肿瘤细胞来源的Ig序列表达高度同源，研究发现在B细胞表达的Ig数据库均未发现这些序列，提示Ig为非B淋巴细胞产生，来源于肿瘤细胞。肿瘤来源的Ig基因转录本具有独特基因结构，在不同类型的肿瘤细胞，尤其是轻链在所有检测病例均表达极为相似的重排模式（个别碱基的替换）或同一结构保守序列，即Vκ4-1-Jκ3型Ig转录本。
　　考虑到Vκ4-1-Jκ3型Igs最初发现于肿瘤，因此可能成为肿瘤研究、诊断乃至治疗的靶点，关键在于获得针对Vκ4-1-Jκ3结构特异性抗体。作为与北京大学邱晓彦教授的合作课题，课题组前期利用生物信息学方法分析预测了Vκ4-1-Jκ3型Ig两个特异性的B细胞识别表位，设计合成三个短肽，分别为QF20(QAEDVAVYYCQQYYDTPVTF), AL13(序列 ASINCKSSQRVSL), AL13B(TQSPDSLVVSLGERASINCKSSQRVSLG，即AL13的延长序列)，并获赠邱晓彦教授课题组提供的原核表达Vκ4-1-Jκ3型Ig融合蛋白(GST-Vκ4-1-Jκ3)。以合成肽AL13B-KLH、原核蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3免疫小鼠获得系列单克隆抗体。获得的抗Vκ4-1-Jκ3型Ig特异性表位抗体，为研究非B淋巴细胞、组织液以及血液中可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig表达提供强有效工具。
　　本项研究主要目的是对抗Vκ4-1-Jκ3型Ig特异性表位单抗的鉴定以及建立双单抗夹心ELISA检测体系及其应用。我们用ELISA鉴定抗体的特异性，这部分工作主要是在课题组前期抗Vκ4-1-Jκ3型Ig单抗制备工作的继续。Vκ4-1-Jκ3型Ig最早发现于上皮来源肿瘤细胞，拟建立双单抗夹心ELISA检测体系，检测可溶性（分泌型）Vκ4-1-Jκ3型Igκ，观察正常人与肿瘤病人血清中的Vκ4-1-Jκ3型Ig表达总量是否存在差异。
　　双单抗夹心ELISA检测Vκ4-1-Jκ3型Ig体系建立与应用
　　抗Vκ4-1-Jκ3单抗特异性的鉴定 Vκ4-1-Jκ3型Ig早期发现来源于上皮性肿瘤，基本结构与正常Ig相同。课题组前期采用原核蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3免疫小鼠获得了单克隆抗体4E9与1A3;用合成肽AL13B-KLH免疫小鼠获得单克隆抗体6G5、5D3与3H9.2。采用辛酸硫酸铵沉淀法纯化单抗，ELISA鉴定纯化后的单抗以及生物素标记单抗的特异性。结果显示抗Vκ41-Jκ3型Ig单抗能特异性地与原核重组蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3结合，且与人IgG与鼠IgG并无交叉反应。因此5种抗Vκ4-1-Jκ3型Ig单抗与生物素标记单抗均可用于后续双单抗夹心ELISA体系的建立。
　　双单抗夹心ELISA检测Vκ4-1-Jκ3型Ig体系建立本章工作的主要目的是建立双单抗夹心ELISA检测体系，并以此检测正常人与肿瘤患者可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig水平及表达规律。本课题组前期工作建立单多抗夹心ELISA检测体系(1A3-标准血清-HRP-IgA，1A3-标准血清-HRP-IgG和1A3-标血清-HRP-IgM)检测显示正常人血清与肿瘤患者血清Vκ4-1-Jκ3型Ig含量有明显差别，表现为肿瘤患者血清中可溶性Vκ4-1-Jκ3型IgA与IgG含量显著高于正常人;而Vκ4-1-Jκ3型IgM明显低于正常人。在此基础上，我们尝试建立双单抗夹心ELISA体系检测可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig，结果显示双单抗夹心ELISA体系可特异性结合标准品融合重组蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3，不能结合正常人血清与肿瘤血清Vκ4-1-Jκ3型Ig，未检测血清与肿瘤病人血清Vκ4-1-Jκ3型Ig总量表达存在有差异。因此不能用此体系检测肿瘤血清与正常血清Vκ4-1-Jκ3型Ig总量。
　　第二部分 ECDI交联的人脾淋巴细胞诱导供者特异性耐受的体系初步建立
　　ECDI即1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimide），是一种易潮湿、水溶性的化学药物，广泛应用于肽的合成。ECDI与肽和蛋白的偶联主要是通过激活游离的羧基，促使激活的羧基与亚胺形成共价肽。1979年Miller等首次提出ECDI联合抗原递呈细胞APC具有诱导耐受的潜力并证实ECDI-APC会诱使效应T细胞无能以及抗原特异性无反应性。ECDI偶联抗原在某些在某些自身免疫性疾病如多发性硬化，自身免疫性糖尿病，实验性自身免疫性脑脊髓炎可诱导自身免疫耐受。
　　如何在移植患者体内诱导供者特异性免疫耐受，从而最终避免排斥反应，停用，甚至不用免疫抑制药物是移植学研究的重要目标之一。诱导供者特异性免疫耐受的策略之一是在移植前将供者抗原暴露于受体。此类暴露方法的最关键之处是确定暴露的具体条件，以确保诱导受体耐受而不是引起受体致敏。这种类似于“幼儿计划免疫接种”的方法自从1980年代以来进行了多次实验，终因产生致敏和促血栓形成等多种因素被排除在临床应用之外。近期，有学者通过应用一种ECDI把自身免疫疾病相关的肽或蛋白交联到脾细胞，并输注至自身免疫疾病动物模型，成功在实验性自身免疫性脑炎(EAE)和自身免疫性糖尿病(T1D)模型诱导抗原耐受。
　　Xunrong Luo首次把这种策略转换到移植耐受领域，通过输注ECDI处理的供者脾细胞(ECDI-SPs)，在MHC完全错配的小鼠胰岛移植中成功诱导胰岛移植物的无限期存活。该研究方案基于完全不用免疫抑制剂，不需要短暂细胞删除、抗体介导的共刺激信号阻断、或移植前应用免疫抑制药物等措施。进一步研究显示ECDI-SPs输注通过多种机制来影响宿主异基因反应，包括克隆清除、无能和免疫调节，这些机制通过协同作用来诱导高效的移植免疫耐受。除在小鼠同种异体和异种异体的胰岛细胞移植模型中观察到ECDI-SPs可诱导长期移植耐受，并且，在输注前删除B细胞可有效诱导出异种胰岛移植物的无限期存活。研究还显示ECDI-SPs可显著延长在MHC完全错配的心脏移植物的存活，并且，短期应用雷帕霉素(rapamycin)可诱导受体心脏移植物无限期存活。
　　目前工作拟在前期研究工作的基础上，通过体外混合淋巴细胞实验，与输注人类脾淋巴细胞至NOD-SCID小鼠（即重症联合免疫缺陷小鼠，T和B细胞缺陷）建立人源化小鼠模型进行ECDI-SPs体内实验阐明ECDI-SPs诱导下人淋巴细胞各亚群异基因反应性的动态变化规律和机制;研究模拟同种异基因移植环境下，人类ECDI-SPs诱导人淋巴细胞抗原特异性免疫耐受的效果，深入探讨针对供者特异性免疫耐受机制。
　　ECDI-SPs诱导供者特异性耐受体系的建立
　　初步研究人类ECDI-SPs诱导异基因T淋巴细胞各亚群的活化、增殖、凋亡的动态变化规律主要采用混合淋巴细胞实验进行流式检测观察ECDI-SPs在体外对受者淋巴细胞的影响，包括增殖，抑制增殖与凋亡的变化规律。研究结果显示ECDI-SPs诱导方案显示可特异性抑制T细胞亚群的增殖。ECDI可诱导其处理的人脾淋巴细胞的凋亡。
　　初步建立NOD-SCID小鼠体内实验模型输注人脾淋巴细胞至NOD-SCID小鼠体内观察一个月内小鼠体内人脾淋巴细胞的存在情况。研究显示，NOD-SCID小鼠采用脂质体清除巨噬细胞以及300cGy照射等预处理后，腹腔注射3×107人脾淋巴细胞在不同时间点均可检测到人脾淋巴细胞的存在，初步建立了NOD-SCID小鼠体内实验模型。后期可在此基础上进行优化，进行体内实验。

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