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豚鼠血迷路屏障对PPTA的通透性以及PPTA对豚鼠突发感音神经性耳聋保护机制研究

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摘要

第一部分 超高效液相色谱／串联质谱分析耳蜗外淋巴液中盐酸椒苯酮胺

1．1 前言

1．2 实验部分

1．3 结果与讨论

1．4 结论

参考文献

第二部分 PPTA对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤IL-1β和TNF-α mRNA表达的影响

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

全文结论

缩略词表

综述 突发感音神经性耳聋的发病机制研究进展

硕士在读期间的论文发表

致谢

声明

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摘要

De Kleyn在1944年提出了突发感音神经性耳聋的概念，并将其定义为至少超过3天连续3个频率听力下降至少30dB。感音神经性耳聋可以通过病史及听力检查等来确定。听力减退是一种非常常见的疾病，不同的大型调查得出的数据有所出入，De Kleyn认为其发病率大约在0.05‰至0.2‰。全球性的调查发现突发感音神经性耳聋的发生率在每年0.03％。但是德国的调查认为该病发病率为1.6‰。血管因素是目前突发感音神经性耳聋的一个重要发病机制假说，以前学者们都在研究耳蜗缺血所导致的突发感音神经性耳聋，目前正在转向研究耳蜗的缺血-再灌注损伤。
　　缺血再灌注损伤的动物模型制作方法较多，使用较为多的是Kuaskari的经听泡途径直接压迫迷路动脉制作缺血再灌注模型及通过开颅或颈部切口压迫椎动脉制作缺血再灌注模型。但是这些方法都有其明显的劣势，本文使用的是颈颈部正中切口分离出双侧椎动脉及一侧颈总动脉，夹毕1h来制作缺血模型，同时松开以制作再灌注模型。此方法较为简单，便于观察，术后豚鼠存活率较高。
　　目前临床上治疗突发感音神经性耳聋主要是通过静脉或局部给予糖皮质激素及扩血管溶栓等治疗为主，对缺血再灌注给内耳带来的的损害作用欠佳，如何阻止缺血再灌注对于内耳组织的损害成为治疗缺血性内耳疾病的关键问题。
　　盐酸椒苯酮胺(piperphentonamine hydrochloride，PPTA)是由广州市众为生物技术有限公司和中国医学科学院药物研究所合作自主研制的钙增敏剂类强心药及心肌保护剂，为首次合成的全新化合物，其药物物质及其合成工艺等3个相关专利已获授权，属1.1类化学药。大量研究表明盐酸椒苯酮胺对脑、心脏、耳蜗的缺血再灌注损伤具有良好的保护作用。并在已完成126例中国健康受试者的Ⅰ期临床试验中显示了良好的耐受性，目前正准备做第Ⅱ期临床试验。目前，盐酸椒苯酮胺能否通过血迷路屏障以及不同浓度、不同时间点注射PPTA对于突发感音神经性耳聋的保护作用是否不同仍不清楚。本文研究主要目的为探知盐酸椒苯酮胺对于豚鼠耳蜗血迷路屏障的通过性及盐酸椒苯酮胺对于豚鼠突发感音神经性耳聋中IL-1β及TNF-αmRNA表达的影响，主要分一下两部分。
　　第一部分超高效液相色谱/串联质谱分析耳蜗外淋巴液中盐酸椒苯酮胺
　　突发感音神经性耳聋是影响公众身体健康和生活质量的重要因素，由缺血再灌注损伤导致的感音神经性耳聋是耳聋发病的重要因素之一，盐酸椒苯酮胺能够改善缺血再灌注损伤所致的感音神经性耳聋。本文首次通过超高效液相色谱/质谱测定建立一快速、准确、高效灵敏的耳蜗内淋巴液中盐酸椒苯酮胺分析方法。经Oasis? MCX(30um)固相提取法富集净化，以Waters-ACQUlTY UPLC BEH C18(1.7 um，2.1mm i.d.×50mm)色谱柱分离，乙腈-水位流动相梯度洗脱，在4min中内可完成分离检测。豚鼠耳蜗外淋巴液盐酸椒苯酮胺浓度在1.2～480ng内线性关系良好，相关系数r＞0.99。分低、中、高三个水平，盐酸椒苯酮胺的回收率分别为81.4％、85.3％、89.6％相对标准偏差为7.3％、7.2％、4.1％。日内、日间RSD均＜10％，稳定性试验RSD＜10％。本方法快速、准确、灵敏度高、专属性强，适用于豚鼠耳蜗外淋巴液盐酸椒苯酮胺浓度检测。
　　关键词:超高效液相色谱;盐酸椒苯酮胺;固相萃取;耳蜗外淋巴液
　　第二部分盐酸椒苯酮胺对突发性感音神经性耳聋IL-1β和TNF-α的mRNA表达的影响
　　探讨盐酸椒苯酮胺对缺血再灌注损伤所致的突发感音神经性耳聋的耳蜗组织的保护作用机制。通过夹毕双侧椎动脉及一侧颈总动脉制作缺血再灌注模型，54只豚鼠随机分成九组，正常组、I/R1d组、2.5mg/Kg PPTA(ST)组，5mg/Kg PPTA(ST)组，10mg/Kg PPTA(ST)组，I/R3d组、2.5mg/Kg PPTA(3d)组，5mg/Kg PPTA(3d)组，10mg/Kg PPTA(3d)组，每组6只。缺血再灌注成功后，立即给予PPTA(ST)组豚鼠股静脉注射术前配置好的PPTA，剂量分别为2.5mg/kg、5mg/kg及10mg/kg。缺血再灌注成功后48h，分别给PPTA(3d)注射PPTA，剂量分别为2.5mg/kg、5mg/kg及10mg/kg。缺血再灌注组注射等量生理盐水，正常组不做处理，24h后测ABR，断头，取右耳耳蜗，用RT-PCR法检测IL-1β和TNF-α的mRNA表达量。用SPSS13.0软件对实验数据进行One-way ANOVA，P＜0.05为有统计学意义。PPTA用药组的ABR RT阈移较缺血再灌注组明显降低，且阈移值与PPTA用药量成反比。荧光定量PCR产物溶解曲线分析显β-actin、IL-1β、TNF-α三个基因的溶解曲线均呈现单峰，表明扩增产物特异性良好。以β-actin为内参，用2-△△CT法进行相对定量，表明与正常组相比各组IL-1β mRNA表达量明显升高（均P＜0.01），与正常组相比各组间TNF-α的mRNA表达量均明显升高（均P＜0.01）。
　　与I/R1天组相比，PPTA(ST)各剂量组的IL-1β mRNA的表达量明显降低（均P＜0.01）。且随着用药剂量的增大，IL-1β mRNA的表达量逐渐降低（均P＜0.001）。与I/R3d组相比，PPTA(3d)各剂量组的IL-1β的mRNA表达量均降低（均P＜0.01）。2.5mg/Kg PPTA(3d)组和5 mg/Kg PPTA(3d)组IL-1β的mRNA表达量间差异无明显统计学意义，10 mg/Kg PPTA(3d)组IL-1β mRNA的表达量明显低于5 mg/Kg PPTA(3d)组（均P＜0.05）。
　　与I/R1天组相比，PPTA(ST)各剂量组的TNF-α mRNA的表达量明显降低（均P＜0.01）。且随着用药剂量的增大，TNF-αmRNA的表达量逐渐降低（均P＜0.01）。与I/R3d相比，PPTA(3d)各剂量组的TNF-α mRNA表达量均降低（均P＜0.001），2.5mg/Kg PPTA(3d)组TNF-α mRNA的表达量明显高于其余两组(均P＜0.05)。5 mg/Kg PPTA(3d)组TNF-α mRNA的表达量明和10mg/Kg PPTA(3d)组差异无明显统计学意义。
　　综上所述，PPTA具有降低耳蜗组织IL-1β和TNF-α mRNA的表达而拮抗缺血再灌注损伤及保护听力。

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