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【6h】

基于HIV-1 gp41 NHR结构域的亚单位疫苗及融合抑制剂研究

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前言

第一章 基于HIV-1 gp41包膜糖蛋白NHR结构域的N63Fc融合蛋白的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章 N63Fc融合蛋白作为亚单位疫苗的初步免疫学的分析

1 材料和方法

2 方法

3 实验结果

4 讨论

第三章 基于HIV-1 gp41 NHR结构域N51FdFc重组蛋白功能的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

综述

中英文缩略词

论文发表情况

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摘要

研究背景:
　　 HIV主要感染人类免疫系统的CD4+T淋巴细胞，特征性地引起CD4+T细胞逐步减少和进行性免疫缺陷，进而诱发艾滋病（获得性免疫缺陷综合征），导致机会性感染并最终导致死亡。虽然高效抗逆转录药物在控制病毒复制，减缓疾病进程方面取得了显着的进展，但昂贵的治疗费用、耐药株的出现、药物的副反应等，严重阻碍了其持久广泛地应用。尤其是在感染人数众多的亚洲和非洲等发展中国家，研制有效的疫苗是控制艾滋病蔓延的最佳途径，也是当前科研工作者的紧迫任务。
　　 艾滋病疫苗是当今时代最具挑战性的科学难题之一，现有的以诱导体液免疫为目的的HIV-1抗原均难以诱导有效的、持续的广谱中和抗体。诱导HIV体液免疫反应的疫苗主要是采用HIV-1包膜糖蛋白作为免疫原。HIV-1包膜蛋白基因全长约2.6kb，是HIV-1变异性最强的基因，编码病毒的包膜糖蛋白(Env)，翻译后形成前体蛋白gp160，经蛋白酶裂解成跨膜蛋白gp120和跨膜蛋白gp41。三分子的gp120/gp41共同形成病毒包膜上的突起，介导病毒进入宿主细胞。因此，gp120和gp41在诱导机体产生针对病毒的中和抗体，促进病毒进入宿主细胞方面起着至关重要的作用。
　　 近年来，一些具有广谱中和活性的人源mAb，如2F5、4E10、Z13、PG16、VRC01等的发现及其相应抗原表位的阐明，给以诱导HIV中和抗体为目标的艾滋病疫苗研究带来了新的希望。这些中和抗体的抗原表位靶向HIV包膜糖蛋白gp120和gp41。由于gp41比gp120的序列更为保守及较少的糖基化位点，基于gp41的HIV亚单位疫苗可能比基于gp120的HIV亚单位疫苗具有更强更广谱的保护作用。为此，本文对源于gp41NHR区域的抗原进行改造，选择gp41NHR结构域的全长序列作为免疫原，并使之与能天然形成三聚体的噬菌体Fd片段或人IgGFc片段融合，构建了重组蛋白N63Fc和N51FdFc。这些蛋白能稳定存在于溶液中，并维持天然的三聚体构象，尽管未能诱导中和抗体，但具有很强的免疫原性。此外，这些三聚体蛋白本身还能抑制HIV-1的感染，阻止HIV病毒的早期进入。这为今后研制针对变异快速，多样性复杂的艾滋病病毒的HIV疫苗和HIV融合抑制剂提供了新思路。
　　 方法和结果:
　　 一、基于HIV-1gp41包膜糖蛋白NHR结构域的N63Fc融合蛋白的研究
　　 1.pGEX/N63Fc表达载体的构建
　　 运用常规PCR方法，以pHXB2-env质粒为模板，用上、下游引物N63fuEcos和N63fubga扩增N63基因片段。EcoRⅠ和BgIⅡ双酶切表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2(IL2ss)和N63基因的PCR产物，进行目的基因和质粒的连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂布于含氨苄霉素的平板，次日挑取单克隆菌落接种子3mlLB培养基中，37℃振荡培养过夜。小量提取质粒，进行双酶切和PCR鉴定并送样测序，正确的阳性克隆命名为pFUSE/N63。
　　 再以pFUSE/N63阳性质粒为模板，用上、下游引物N63FCbms和N63FCEcoa进行PCR扩增以获得N63Fc基因片段。BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切表达载体pGEX-6p-1和N63Fc基因的PCR产物，进行目的基因和质粒的连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂布于含氨苄霉素的平板，次日挑取单克隆菌落接种于3mlLB培养基中，37℃振荡培养过夜。小量提取质粒，进行双酶切和PCR鉴定并送样测序，正确的阳性克隆命名为pGEX/N63Fc。
　　 2、N63Fc融合蛋白的表达
　　 以pGEX/N63Fc阳性质粒转化大肠杆菌Rosetta2(DE3)表达载体，挑单克隆，37℃培养过夜，再按1:100的比例扩大培养，IPTG诱导3小时后，分别收集上清和沉淀，用适量PBS重悬沉淀。取上清和菌体沉淀，按常规方法进行SDS-PAGE电泳分离总蛋白，并电转至硝酸纤维素膜上，以兔抗NY363为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，进行WesternBlot免疫印迹分析。结果表明，N63Fc融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，可被兔抗NY363特异性识别，反应条带的大小与推算的分子量33KD相符，表明N63Fc重组蛋白在大肠杆菌体系得到成功表达。
　　 3、N63Fc融合蛋白的活性检测
　　 1)N63Fc融合蛋白天然构象的分析
　　 N-PAGE方法区别于常规的SDS-PAGE，在于不加SDS而且不需要对样品进行加热变性处理，因此N-PAGE中样品的移动与其分子量和电荷相关。我们对N63Fc融合蛋白进行了热变性处理，并用N-PAGE方法检测了N63Fc融合蛋白的天然构象。结果发现煮的N63Fc融合蛋白变性后成一条带;不煮的N63Fc融合蛋白却有三条带，表明天然的N63Fc蛋白呈现三聚体构象，具有一定的生物学活性。
　　 2).圆二色谱法分析N63Fc蛋白的二级结构
　　 我们采用圆二色谱法检测了N63Fc蛋白的二级结构。结果表明单独的N63多肽没有α-helicity结构，N63Fc蛋白显示了复杂的二级结构，但当N63Fc蛋白与C34孵育后形成了α-helicity结构，而且N63Fc-trimer比N63多肽更易于和C34多肽相互作用，形成α-helicity结构的能力更强。但C34/N36复合物的α-helicity结构比C34/N63Fc更好。
　　 3).N63Fc融合蛋白抑制了H9/HIV-1ⅢB细胞与MT-2细胞的早期融合H9/HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞用含10％FBS的RPMI1640培养基在37℃，5％CO2培养箱培养，2-3d传代1次。先对H9/HIV-1ⅢB细胞进行分子荧光探针Calcein-AM荧光染色，按1mLH9/HIV-1ⅢB细胞加入2.5ul1mmol/LCalcein-AM。收集对数生长期的H9/HIV-1ⅢB细胞，计数并配制4×108/L细胞悬液。然后将Calcein-AM标记的H9/HIV-1ⅢB细胞加到96孔板，每孔25ul细胞悬液，分别加入2倍倍比稀释的N63Fc融合蛋白或N63多肽，另外设不加药物的病毒对照组和T20阳性对照组，每组样本设3个复孔，37℃孵育30min。接下来每孔加入50ul处于对数生长期的MT-2细胞(细胞浓度2×109/L)，同时设仅加MT-2细胞的空白对照。37℃孵育2h后在倒置荧光显微镜下观察细胞的融合，每孔随机计数4个视野，取均值，计数不同稀释度下的融合细胞数。
　　 MT-2细胞具有CD4受体，H9/HIV-1ⅢB和MT-2细胞混合后在倒置荧光显微镜下观察H9/HIV-1ⅢB细胞被CalceinAM染色后，能发出较强的绿色荧光，而体积较小，单独的MT-2细胞没有染色不能发出荧光。H9/HIV-1ⅢB和MT-2细胞共同孵育2h后，如发生融合，则MT-2与H9/HIV-1ⅢB融合细胞能发出荧光，但荧光强度弱于未融合的H9/HIV-1ⅢB细胞（荧光素扩散到两个细胞），细胞体积较大，因此很易区分融合和未融合细胞。本实验结果显示游离的N63多肽对HIV的进入没有阻止作用，其IC50值在uM以上;而改造后的N63Fc融合蛋白可显着阻止HIV-1进入靶细胞，其抑制IC50为82nM，与T20的抑制率接近(P＜0.05)。
　　 4)N63Fc融合蛋白能中和HIV-1ⅢB和HIV-1Bal活病毒感染
　　 MT-2细胞于37C、5％CO2培养，每隔3天传代一次。当MT-2细胞处于对数生长期时，将HIV-1ⅢB病毒按一定滴度与2倍倍比稀释的N63Fc融合蛋白或N63多肽于37℃共孵育1h，然后加入MT-2细胞，其中设立已知中和滴度的阳性对照孔作为检测标准，隔天换液一次，37℃再培养3d。离心96孔细胞培养板，吸取细胞培养上清液做p24抗原检测（按试剂盒说明书进行）。结果表明游离的N63多肽对HIV的进入没有阻止作用，其IC50值在uM以上;而改造后的N63Fc融合蛋白显著抑制了HIVp24抗原表达，其抑制IC50为133nM，抑制活性接近T20(P＜0.05)。
　　 TZM-b1细胞于37℃、5％CO2培养，每隔3天传代一次。当TZM-b1细胞处于对数生长期时，将Bal病毒按一定滴度与2倍倍比稀释的N63Fc融合蛋白或N63多肽于37℃共孵育1h，然后加入TZM-b1细胞，其中设立已知中和滴度的阳性对照孔作为检测标准，37℃再培养3d。结果表明游离的N63多肽对HIV的感染没有抑制作用，其IC50值在uM以上;而改造后的N63Fc融合蛋白显着抑制了HIV-1Bal病毒的感染，IC50为103nM，抑制活性也接近T20(P＜0.05)。本文的研究工作为基于HIV-1gp41NHR区域的融合抑制剂提供了理论基础。
　　 二、N63Fc融合蛋白作为亚单位疫苗的初步免疫学研究
　　 BALB/c雌性小鼠24只，5周龄，分为3个免疫组和一个空白对照组，每组6只。以20ug的抗原剂量免疫小鼠4次，空白对照组不注射抗原。在第1、30、50、57天免疫后，收集血清用于抗体滴度检测。结果表明抗原能诱导小鼠产生针对N63Fc重组蛋白的特异性抗体，最高抗体效价可达到106。
　　 为了检测抗N63Fc血清是否具有中和HIV活病毒的作用，我们取第三次免疫后的血清按1:20的比例稀释，按照中和试验操作方法进行HIV-1ⅢB和Bal实验室株中和试验。结果发现阴性对照组的抑制率分别是31％和36％，Fc组的抑制率是35％，而N63Fc组的抑制率是32％。通过比较，可以认为N63FC融合蛋白的免疫血清没有中和ⅢB病毒的活性。同样的，当免疫血清1:20稀释时，阴性对照组对HIV-1Bal病毒的抑制率分别是35％和31％，Fc组的抑制率是31％，而N63Fc组的抑制率是33％(P＜0.05)。本文研究结果表明N63Fc融合蛋白能诱导小鼠的特异性体液反应，产生的抗体效价高，特异性强，而且这种抗体能识别HIV-1gp41NHR的疏水口袋区域，但这种抗体不能抑制HIV进入靶细胞，也不能抑制HIV-1ⅢB和Bal活病毒株的感染。
　　 在抗体交叉反应实验中，抗N63Fc的血清并不能很好地识别IQN17这个源于gp41NHR(N17)的三聚体，为此我们认为可能是因为这个疫苗的空间结构不好，因而不能发挥更好的作用，为此我们重新设计了源于gp41NHR的疫苗。
　　 三、基于HIV-1gp41包膜糖蛋白NHR结构域N51FdFc重组蛋白的功能研究
　　 1.pFUSE/N51Fd表达载体的构建
　　 首先运用CO-PCR方法，以pNBJ-3质粒为模板，用上、下游引物扩增N51ⅢB基因片段，第二步以Foldon片段和第一步产物为模板扩增N51Fd-ⅢB基因。
　　 采用引物自连的方法先扩增N51-BC的部分片断，再以第一步产物为模板扩增出N51-BC基因，第三步以foldon片段和第二步产物为模板扩增出N51Fd-BC基因。同样的，采用引物自连的方法扩增N51-AE的部分片断，再以第一步产物为模板扩增出N51-AE基因，第三步以foldon片段和第二步产物为模板扩增出N51Fd-AE基因。然后将目的基因分别插入到真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2(IL2ss)中，构建了重组质粒pFUSE/N51F。EcoRⅠ和BglⅡ双酶切pFUSE-hIgG1-Fc2(IL2ss)和N51Fd基因的PCR产物后，进行目的基因和质粒的连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂布于含博来霉素的平板，37℃培养12-16小时。次日挑取单克隆菌落接种于3mlLB培养基中，37℃振荡培养过夜。小量提取质粒，进行双酶切和PCR鉴定和送样测序，正确的阳性克隆命名为pFUSE/N51Fd。结果显示，N51ⅢB-Fd、N51BC-Fd和N51AE-Fd的引物扩增了目的基因片段，在253bp处出现了目的基因条带。
　　 2、N51FdFc重组蛋白的表达
　　 以测定的阳性质粒转染HEK293T细胞48h后，运用RT-PCR检测转染后重组蛋白在真核细胞中的表达。取细胞培养上清，运用proteinA亲和柱纯化N51FdFc重组蛋白。
　　 3、N51FdFc重组蛋白的活性检测
　　 1)N51FdFc蛋白的特异性检测
　　 分离总蛋白，取25μg蛋白按常规方法进行SDS-PAGE电泳，并电转至硝酸纤维素膜上，以NY363为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，进行WesternBlot分析。结果表明表达的重组蛋白可被NY363兔抗特异性识别，N51FdFc目的蛋白得到了正确表达。
　　 取10μg/ml的包被浓度进行N51FdFc重组蛋白的ELISA检测。从各组的数值来看，相同浓度下阳性对照和样品的吸收值接近。因此初步确定目的蛋白在真核细胞中得到了正确的表达。
　　 2).圆二色谱法分析N51FdFc蛋白的二级结构
　　 我们采用圆二色谱法检测了N51FdFc蛋白的二级结构。结果表明单独的N51FdFc蛋白显示了复杂的二级结构，但当N51FdFc蛋白与C34孵育后形成了α-helicity结构。与N51FdFc-ⅢB和N51FdFc-AE蛋白相比，N51FdFc-BC蛋白更易于和C34多肽相互作用，形成α-helicity结构的能力更强。
　　 3).N51FdFc融合蛋白抑制了H9/HIV-1ⅢB细胞与MT-2细胞的早期进入
　　 本实验结果显示N51FdFc-ⅢB，N51FdFc-BC，N51FdFc-AE融合蛋白可显着阻止HIV病毒进入靶细胞，其IC50分别是95nM，66nM，78nM。抑制活性接近T20(P＜0.05)。
　　 4).N51FdFc融合蛋白能中和HIV-1ⅢB和Bal活病毒
　　 在HIV-1ⅢB中和试验中，N51FdFc-ⅢB，N51FdFc-BC，N51FdFc-AE融合蛋白能抑制p24抗原表达，其IC50分别为152nM，93nM和97nM，抑制活性接近T20(P＜0.05)。N51FdFc-ⅢB，N51FdFc-BC，N51FdFc-AE融合蛋白对HIV-1Bal毒株的IC50分别为143nM，76nM和84nM，抑制活性也接近T20(P＜0.05)。来源于BC亚型的N51FdFc融合蛋白抗HIV活性最强。
　　 此外，我们挑选BC亚型的N51FdFc融合蛋白作为抗原，按照N63Fc融合蛋白免疫实验的方法，对小鼠进行免疫。结果显示小鼠抗血清没有中和活性。
　　 结论:
　　 以往的研究结果表明HIV-1gp41的NHR是弱免疫原，而且其抑制HIV感染的活性比衍生于gp41CHR的多肽低几个数量级。因为游离的衍生于gp41NHR的N多肽会聚集，因而不能形成稳定的三聚体构象。
　　 1.本文对源于gp41NHR结构域的N63多肽及N51进行改造，使之与人Fc片段
　　 或再与噬菌体Fd片段融合。结果发现这些设计融合蛋白能维持三聚体构象，具有比容易N-多肽更强的抗HIV活性，其IC50接近T20;
　　 2.这些设计的NHR融合蛋白作为免疫原未能诱导出具有病毒中和活性的抗体;
　　 3.N63Fc融合蛋白能够在原核系统可溶性表达，与合成多肽T-20相比，具有高活性、低成本的优势，可进一步作为艾滋病防治药物进行研发。

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