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新型主动靶向性MR对比剂——生物素化脂质体SPIO纳米微粒的初步制备及评价

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摘要

恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的最严重疾病之一,每年死于恶性肿瘤的患者高达数百万,造成劳动力的巨大损失和社会资源的惊人消耗,同时给患者及其家属带来巨大的经济和精神压力。因此恶性肿瘤已经成为全人类共同关注的重大课题。目前,具有肿瘤靶向超顺磁氧化铁纳米微粒由于其在MRI诊断、热疗及靶向给药中潜能,是目前靶向制剂研究中很热门的课题。本课题尝试制备能逃避网状内皮系统吞噬作用的主动靶向性MR对比剂——生物素标记的PEG化脂质体SPIO(Biotin-PEG-liposome SPIO)纳米微粒,设想利用“三步法”抗体预定位技术的靶向定位作用及生物素-亲和素系统(biotin-avidin system,BAS)的生物放大效应,提高生物素化单克隆抗体和生物素标记的脂质体SPIO的结合量,提高肿瘤局部MR对比剂浓度,增加信号强化程度,达到提高MR分子免疫成像的敏感性的目的,为肿瘤及其转移灶的早期诊断、术后复发与术后纤维瘢痕的鉴别诊断等探索新的途径。本课题还对所制备的Biotin-PEG-liposomeSPIO纳米微粒的理化特性、生物素活性、细胞毒性及在体内外抗巨噬细胞吞噬作用与肿瘤靶向性MR成像效果等进行了初步评价。
　　 第一章生物素-亲和素系统预定位技术介导的新型主动靶向性腿对比剂——Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的制备及其理化生物特性的初步研究
　　 研究目的：
　　 制备新型生物素-亲和素系统预定位技术介导的主动靶向性MR对比剂——生物素标记的PEG化脂质体SPIO(Biotin-PEG-liposome SPIO)纳米微粒,并对其理化性质与细胞毒性进行测定和初步评价,以判断其临床应用的可能性与前景。
　　 第一节生物素-亲和素系统预定位技术介导的新型主动靶向性MR对比剂——Biotin-PEG-liposome SPIO的初步制备
　　 材料及方法：
　　 1月桂酸稳定的超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米微粒的制备:
　　 采用化学共沉淀法制备SPIO,并在碱性条件下与月桂酸反应形成月桂酸稳定的SPIO纳米微粒。
　　 2 Biotin-PEG-liposome纳米微粒的制备:
　　 按摩尔比20:1精密称取一定量DSPG、DSPE-PEG2000-Biotin,采用薄膜分散法合成Biotin-PEG-liposome纳米微粒。
　　 3 Biotin-PEG—liposome SPIO纳米微粒的制备:
　　 将上述月桂酸稳定的SPIO及Biotin-PEG-liposome以一定比例混合,加入TES缓冲液(5mM,PH=7.0),透析3天,过凝胶柱去除过大的脂质体及游离的磷脂,制得Biotin—PEG—liposome包被的SPIO纳米微粒——Biotin—PEG-liposomeSPIO。
　　 第二节生物素-亲和素系统预定位技术介导的新型主动靶向性MR对比剂——Biotin—PEG—liposome SPIO的理化性质测定
　　 材料及方法：
　　 1月桂酸稳定的SPIO、Biotin—PEG—liposome纳米微粒、Biotin—PEG-liposomeSPIO纳米微粒透射电子显微镜下形态观察:
　　 取少量无月桂酸稳定的SPIO及月桂酸稳定的SPIO悬浊液用去离子水稀释后,滴少许于敷有支撑膜的铜网上,静置约5分钟后,用滤纸小片从铜网边缘吸干多余液体,红外灯下静置干燥后,置透射电子显微镜下观察纳米微粒子的大小和形态。
　　 各取一份Biotin-PEG-liposome、Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒悬浊液用去离子水稀释后,滴于有支撑膜的铜网上,静置约5分钟后,用滤纸小片从铜网边缘吸干多余液体；用磷钨酸约20μl负染约30～60s,再用滤纸小片从铜网边缘吸干多余液体,红外灯下静置干燥后,置透射电子显微镜下观察。
　　 2月桂酸稳定的SPIO、Biotin-PEG—liposome纳米微粒及Biotin-PEG-liposomeSPIO纳米微粒粒径及分布的测定:
　　 用Malvern Zetasizer3000HS激光散射粒度分析和电位测定仪测定三种纳米微粒的粒径及分布:三种样品各取5μl,用蒸馏水稀释至测量杯中,放入样品槽中测试。所选激光光源的波长为633.0nm,测试温度为25.00±0.05℃。
　　 3月桂酸稳定的SPIO纳米微粒和Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒中铁含量的测定:
　　 用邻二氮菲法测定月桂酸稳定的SPIO和Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒悬浊液中铁的含量,在所选最大吸收波长λmax=511.5nm处,测定溶液的吸光光度值,根据Fe含量标准曲线计算出样品中铁含量。
　　 4 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒中脂质浓度的测定:
　　 用紫外分光光度计法在所选最大吸收波长λmax=819nm处,测定溶液的吸光度,根据脂质含量标准曲线计算出样品中脂质的含量。
　　 5 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒中生物素含量的测定:
　　 采用Quant TagTM Biotin Kit生物素试剂盒精确测量并计算单位质量纳米微粒的生物素含量。
　　 6 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的X-射线粉末衍射(XRD)分析:
　　 取真空干燥的Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒研细,置于D/Max-ⅢA X-射线粉末(多晶)衍射仪中,采用镍过滤的C(u)Kα放射线,以40/min的速度扫描,扫描范围是20为200°～900°。将所得的图谱与国际粉末衍射标准联合会出版的PDF卡片比较,以此来确定样品所具备的晶体结构。
　　 7 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的磁化率测定:
　　 精密称取真空干燥后的Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒适量,放置于美国Quantum Design公司物理综合测量系统(PPMS-9)中,测定温度为300K,随着外磁场从-4000～4000 Oe的变化,测定纳米微粒磁矩的变化情况,并绘制对应的磁性曲线。磁化率的大小可以反应SPIO的磁响应能力,当外加磁场一定时,磁矩越大表明样品的磁响应能力越强。
　　 8 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒T2值的测定及T2弛豫率的计算:
　　 将Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒悬浊液稀释,并按铁浓度为0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mmol/L分装于7只试管中,置于塑料试管架上,在MR机器上进行横断面扫描,采用8通道头颈部联合线圈,扫描序列采用T2map,随后测量各个浓度试管中部4个层面的T2值,取其平均值,计算样品的T2弛豫率,即含铁浓度与1/T2直线方程的斜率。
　　 结果：
　　 1透射电子显微镜下月桂酸稳定的SPIO、Biotin-PEG-liposome纳米微粒、Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的形态大小:
　　 无月桂酸稳定的SPIO纳米微粒呈现明显的聚集现象,分散度较低。
　　 月桂酸稳定的SPIO纳米微粒呈类圆形、大小均匀的黑色颗粒,较分散,仅有少许团聚现象,电镜下估算其平均粒径约2～14nm。
　　 Biotin-PEG-liposome纳米微粒复染后显示为类圆形白色空泡,表面光整平滑,分布较均匀,相互间无粘连,电子显微镜下估算其平均粒径约5～15nm。
　　 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒负染后显示为类圆形壳核结构,核心为黑色颗粒状,外包绕薄层白边,电镜下估算其平均粒径约8～22nm。
　　 2月桂酸稳定的SPIO纳米微粒、Biotin-PEG-liposome纳米微粒及Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定结果:
　　 月桂酸稳定的SPIO纳米微粒:强均粒径di=123.1nm,峰面积:100％,峰数为1；体均粒径dv=70.7nm,峰面积:100％,峰数为1;数均粒径dn=45.5nm,峰面积:100％,峰数为1；多分散系数为0.227。
　　 Biotin-PEG-liposome纳米微粒:较小的强均粒径di=43.0nm,峰面积:100％,峰数为2；较小的体均粒径dv=43.0nm,峰面积:100％,峰数为2；较小的数均粒径dn=42.7nm,峰面积:100％,峰数为2；多分散系数为0.23。
　　 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒:强均粒径di=132.5nm,峰面积:100％,峰数为1；体均粒径dv=61.4m,峰面积:100％,峰数为1；数均粒径dn=37.6nm,峰面积:100％,峰数为1；多分散系数为0.28。
　　 3月桂酸稳定的SPIO纳米微粒及Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的铁含量测定结果:
　　 铁含量的标准曲线方程:Y=0.1997X+0.0037,R2=0.9992,在0～2.0μg/ml浓度范围内线性关系良好。月桂酸稳定的SPIO纳米微粒悬浊液铁含量为13.06mg/ml；Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒悬浊液铁含量为5.49mg/ml。
　　 4 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的脂质含量测定结果:
　　 脂质含量的标准曲线方程:Y=3.2842X+0.0203,R2=0.9993,在0～2.0μg/ml浓度范围内线性关系良好。Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒悬浊液脂质浓度为S.66μg/ml。
　　 5 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的生物素含量测定结果:
　　 生物素含量的标准曲线方程:Y=0.032X-0.002,R2=0.997,在0.5～10.0 nmol/ml浓度范围内线性关系良好。Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒悬浊液生物素含量为7.36nmol/ml。
　　 6 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的X线衍射物分析结果:
　　 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的主要成份为面心立方尖晶石结构的Fe3O4,且Fe3O4粒子的结晶状态良好,表面PEG修饰的脂质体包裹对SPIO的晶型没有影响。
　　 7 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的磁化率测定结果:
　　 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的矫顽力非常小,具有超顺磁性；质量饱和磁化强度为68.6 emu/g Fe。
　　 8 Biotin—PEG—liposome SPIO纳米微粒悬浊液的T2值测定及T2弛豫率的计算
　　 结果:
　　 Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒悬浊液铁浓度(mmol/L)与1/T2的回归方程为:Y=0.2842X-0.002,R2=0.9974。样本的T2值随着铁浓度的增加逐渐下降,T2弛豫率为0.2842×106mol-1·s-1,高于0.062×106 mol-1·s-1的最低标准。
　　 第三节生物素-亲和素系统预定位技术介导的新型主动靶向性MR对比剂--Biotin-PEG-liposome SPIO的细胞毒性实验(MTT法)
　　 材料及方法：
　　 1人正常肝细胞株L-O2细胞的复苏与培养:
　　 从液氮罐中取出含L-O2细胞的冻存管,直接投入37℃恒温水浴箱,待融化后,离心5min,除去上清液后用含20％PBS的RPMI-1640培养液5 ml重新悬浮细胞后接种培养瓶,置入5％CO2,37℃培养箱中静置培养。当细胞达>80％的融合度时,胰酶消化2min左右,用吸管轻轻吹打细胞,直至贴壁细胞悬浮。
　　 2 MTT法检测药物的细胞毒性:
　　 将L-O2细胞悬液接种于96孔板中(5×103个/孔),培养24h后分别加入未包被裸SPIO悬浊液及Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒悬浊液,浓度分别为每孔铁含量为10μg、20μg、40μg、80μg、120μg、160μg和200μg,每组设3个复孔。以仅含培养基者作为调零孔,以仅含正常L—O2细胞者为正常对照孔。培养24h后,加入浓度为5mg/ml的MTT的D-hanks溶液,继续孵化4h,加入200μlDMSO,平板震荡仪震荡10min,在酶标仪中测定490nm波长处的吸光度值(OD值),并计算细胞存活率,即(样品孔的OD值-样品对照孔的OD值)/正常对照孔的OD值。
　　 3统计学分析:
　　 采用SPSS13.0软件包,利用完全随机分组两因素析因设计法分析资料,并对结果进行方差分析,考察两个处理因素对细胞毒性影响的差异是否有显著统计学意义:第一个因素是药物(drug),有两个水平(“未包被的裸SPIO(=1)”和“Biotin-PEG-liposome SPIO(=2)”)；第二个因素是培养基中铁浓度,有6个水平(100μg/ml(=1)、200μg/ml(=2)、400μg/ml(=3)、600μg/ml(=4)、800μg/ml(=5)和1000μg/ml(=6))。P<0.05则认为有显著性意义。
　　 结果：
　　 随着培养液中铁浓度的增加,两组L-O2细胞生存率均有下降的趋势。未包被的裸SPIO被细胞吞噬后,毒性很大,高浓度时(1000μg Fe/孔)细胞生存率小于20％,其细胞毒性随浓度变化显著。Biotin-PEG-liposome SPIO组的细胞毒性明显低于未包被的裸SPIO组,高浓度时(1000μg Fe/孔)细胞生存率也在80％左右。这表明SPIO经脂质体包被后,细胞毒性明显下降。两种药物对细胞毒性影响的差异有显著统计学意义(P<0.001)。铁浓度对细胞毒性影响的差异亦有显著统计学意义(P<0.001)。
　　 结论：
　　 1.本章采用三步法成功地合成了一种新型超顺磁性氧化铁纳米微粒——生物素标记的PEG化脂质体SPIO(Biotin-PEG-liposome SPIO),粒径约8～22nm,大小较均匀,多分散性好,具有超顺磁性及T2弛豫效应；能够满足超小超顺磁性氧化铁纳米微粒作为长循环肿瘤靶向对比剂的基本要求。
　　 2.本课题合成的Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的生物素含量高,为生物素-亲和素系统介导的肿瘤靶向性MR显像提供了物质基础。
　　 3.本课题合成的Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的细胞毒性小,生物安全性好,生物相容性佳,为临床应用提供了安全保障。
　　 第二章生物素-亲和素系统预定位技术介导的新型主动靶向性MR对比剂——Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的体外及体内抗单核巨噬细胞系统吞噬作用的初步评价
　　 研究目的：
　　 体外及体内评价我们所制备的Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的抗单核巨噬细胞系统吞噬作用。
　　 第一节生物素-亲和素系统预定位技术介导的新型主动靶向性MR对比剂——Biotin-PEG-liposome SPIO的巨噬细胞体外吞噬实验
　　 材料及方法：
　　 将冻存的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7复苏后接种于培养瓶中,加含10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养液适量,37℃,5％CO2条件下培养24h；待细胞达到80-90％汇合后,胰酶消化,接种于6孔细胞培养板上(每孔细胞数为5×105/ml),孵化24h后,用PBS液洗涤三遍,加入含铁量800μg Fe/ml的空白SPIO和Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒悬浊液的DMEM全培养液2ml,孵化24h后,再用PBS液洗涤三遍,以未加入SPIO溶液的细胞作为空白对照,每孔分别加入4％的多聚甲醛溶液1ml,固定20min后,加入2％亚铁氰化钾溶液和2％盐酸(体积比2:1)的混合液1ml,37℃下孵育30min后,用PBS液洗三遍,于倒置显微镜下观察,拍照比较RAW264.7细胞与含上述两种纳米微粒的培养基孵化24h后,经普鲁士蓝染色后颜色的差异。
　　 结果：
　　 未加入含铁溶液的空白对照组与RAW264.7细胞孵育24h后,普鲁士蓝染色后,巨噬细胞未见任何蓝染；与空白对照组相比,未包被的裸SPIO组与RAW264.7细胞孵育24h,普鲁士蓝染色后,巨噬细胞被染成亮蓝色；而Biotin-PEG-liposomeSPIO组与RAW264.7细胞孵育24h,普鲁士蓝染色后,巨噬细胞只有少许被染成亮蓝色,大部分呈浅蓝色。
　　 第二节生物素-亲和素系统预定位技术介导的新型主动靶向性MR对比剂——Biotin-PEG-liposome SPIO的健康裸鼠体内分布实验
　　 材料及方法：
　　 将12只健康裸鼠分为三组:空白对照组(n=4)、未包被裸SPIO组(n=4)、Biotin-PEG-liposome SPIO组(n=4)；经尾静脉分别缓慢注射0.05ml生理盐水、未包被裸SPIO悬浊液以及Biotin-PEG—liposome SPIO悬浊液(10mgFe/kg b.w.)。24h后行颈椎脱臼法处死裸鼠,并快速取其肝脏、脾脏、肺脏、肾脏以及心脏组织,固定、包埋、蜡封、脱蜡后行普鲁士蓝染色观察切片上蓝染颗粒分布情况及数量,初步考察未包被的裸SPIO纳米微粒及Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒在健康裸鼠体内各主要器官的分布情况。
　　 结果：
　　 1)空白对照组普鲁士蓝染色:肝脏、脾脏、心脏、肺脏及肾脏各组织内均未见蓝染铁颗粒；
　　 2)未包被裸SPIO组普鲁士蓝染色:肝脏组织可见较多蓝染铁颗粒沉着；脾脏内也可见到较多蓝染铁颗粒；肺组织内见极少量蓝染铁颗粒；肾组织及心脏组织内未见蓝染铁颗粒；
　　 3)Biotin-PEG-liposome SPIO组普鲁士蓝染色:肝脏组织及脾脏组织内可见蓝染铁颗粒,但较未包被裸SPIO组蓝染铁颗粒沉积少；肺组织、肾组织及心脏组织内均未见蓝染铁颗粒。
　　 结论：
　　 我们合成的Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒在体内外均具有良好的逃避网状内皮系统吞噬的能力。
　　 第三章生物素-亲和素系统预定位技术介导的新型主动靶向性MR对比剂——Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒的荷人肺腺癌裸鼠MR成像实验
　　 研究目的：
　　 初步评价我们所制备的Biotin-PEG-liposome SPIO的肿瘤主动靶向性,及“三步法”预定位技术与生物素-亲和素级联放大系统的应用效果。
　　 材料和方法：
　　 1皮下种植型荷人肺癌裸鼠模型的建立:
　　 取处于对数生长期的人肺腺癌细胞A549细胞,胰酶消化,稀释后用1ml注射器在24只裸鼠右侧大腿根部皮下注射细胞悬液0.2ml(1×107个/ml),饲养并定期观察,待肿瘤直径达1～2cm,即可开始后续实验。
　　 2实验动物的分组及处理:
　　 采用随机数字法将上述24只荷人肺腺癌裸鼠随机分成A、B、C三组:A组:主动靶向性对比剂(Biotin-PEG-liposome SPIO)+亲和素+生物素化抗体组(n=4):尾静脉注射单克隆抗体LM60950μg。24h后腹腔内注射冷Av30μg,30min后注射SA10μg。48h后尾静脉注射主动靶向性对比剂(12.5μg Fe/0.2ml/mouse);
　　 B组:主动靶向性对比剂(Biotin-PEG-liposome SPIO)+亲和素+生理盐水组(n=4):尾静脉注射生理盐水(与上述LM609等体积)。24h后腹腔内注射冷Av30μg,30min后注射SA10μg。48h后尾静脉注射主动靶向性对比剂(12.5μgFe/0.2 ml/mouse)；
　　 C组:被动靶向性对比剂(非生物素化PEG-liposome SPIO)+亲和素+生物素化抗体组(n=4):尾静脉注射单克隆抗体LM60950μg。24h后腹腔内注射冷Av30μg,30min后注射SA10μg。48h后尾静脉注射被动靶向性对比剂(12.5μg Fe/0.2ml/mouse)。
　　 3 MRI扫描方法:
　　 采用肘关节线圈,扫描序列参数如下:FSE-T2WI(TR:4000ms,TE:85ms),FSE-T1WI(TR:425ms,TE:Min Full),FOV:10×10cm,层厚1.5mm,层距0mm。平扫结束后:于上述裸鼠尾静脉注射主动/被动靶向性对比剂后1h、2h、4h、6h、8h、12h及24h分别行T2WI-MR增强扫描。
　　 4 MR图像观察与测量:
　　 在T2WI上测量三组荷瘤裸鼠平扫及增强后各时间点肿瘤组织的信号强度(signal intensity,SI)及背景噪声的标准差(Standard deviation of the noise,SDn),计算出信噪比(Signal to noise ratio,SNR),公式为SNR=SI/SDn。绘制三组肿瘤的信噪比-时间动态变化曲线,并计算三组荷瘤裸鼠平扫及强化峰值点肿瘤的信噪比下降百分比(percentage of SNR loss,PSNRL)。
　　 5统计学分析:
　　 采用SPSS13.0统计软件包,应用配对样本t检验(Paired-Samples T Test)比较三组荷瘤裸鼠肿瘤平扫和增强后强化峰值点的SNR是否有显著性差异；应用协方差分析(analysis of covariance,ANCOVA)在扣除三组荷瘤裸鼠肿瘤平扫时SNR差异下比较强化峰值点的SNR是否有显著性差异；应用完全随机设计资料的方差分析(ONE-WAY ANOVA)比较三组荷瘤裸鼠肿瘤实质增强后6h的PSNRL间是否有显著性差异。若结果显示有显著性差异,再行SNK多重比较各组间PSNRL两两比较是否存在显著差异。P<0.05认为有显著性差异。
　　 6三组实验裸鼠肿瘤组织病理学检查:
　　 MR扫描结束后即行颈椎脱臼法处死裸鼠,并快速取其肿瘤组织,固定,包埋,并行HE及普鲁士蓝染色观察。
　　 结果：
　　 1皮下种植型荷人肺癌裸鼠模型的建立:
　　 24只荷瘤裸鼠全部存活,皮下种植人肺腺癌荷瘤裸鼠模型全部成功,瘤体直径1～2cm。
　　 2三组荷瘤裸鼠皮下肿瘤组织T2WI上信噪比动态变化情况。
　　 三组荷瘤裸鼠注射对比剂后,A组肿瘤组织在T2WI上信噪比开始下降,于6小时左右达负性强化最高峰,随后信号缓慢恢复,至24小时仍远远低于平扫时的信号水平；B组、C组肿瘤组织在T2WI上信噪比变化幅度低于A组,但负性强化高峰均位于静注对比剂后6小时处。
　　 3三组荷瘤裸鼠平扫及增强后6小时皮下移植型人肺腺癌组织的信噪比及信噪比降低百分比(PSNRL)比较:
　　 Paired-Samples T Test显示三组荷瘤裸鼠皮下移植型人肺腺癌肿瘤组织平扫及增强后6h的信噪比(SNR)差异均有显著统计学意义(t=651.701,P<0.001),说明三组荷瘤裸鼠注射对比剂后6小时均可见明显的肿瘤信号降低,即负性强化效果。
　　 ANCOVA结果显示在剔除平扫时肿瘤SNR差异的影响后,三组荷瘤裸鼠肿瘤组织增强后6h的SNR差异均有显著统计学意义(F=6675.979,P<0.001)；且结合调整后的均数,说明A组负性强化效果优于B组,B组负性强化效果优于C组。可见只有尾静脉注射主动靶向性对比剂(Biotin-PEG-liposome SPIO)+亲和素+生物素化抗体的A组荷瘤裸鼠肿瘤部位信号降低最为显著(呈负性增强),而未注射生物素化抗体的B组及未注射靶向性对比剂的C组肿瘤增强前后亦显示信号减低,但强化效果均不如A组明显。
　　 ONE-WAY ANOVA结果显示三组荷瘤裸鼠肿瘤实质增强后6h的PSNRL间差异有显著统计学意义(F=3055.533,P<0.001)。进一步的SNK多重比较示各组PSNRL间两两差异均存在显著统计学意义(P<0.001),以A组降低最为显著,B组其次,C组降低最不明显。
　　 4三组荷瘤裸鼠肿瘤组织病理学检查结果:
　　 HE染色图片显示裸鼠皮下种植型人肺腺癌肿瘤组织细胞较致密,核大而圆,且深染,呈蓝色；细胞质较少,呈淡红色。
　　 普鲁士蓝染色图片显示三组裸鼠肿瘤组织内清晰可见散在蓝染颗粒,数量以A组最多,B组其次,C组较少。
　　 结论：
　　 基于BAS系统的三步法预定位技术,应用我们合成的新型靶向性MR对比剂——Biotin-PEG-liposome SPIO纳米微粒可初步实现肿瘤组织的主动靶向性MR显像。
　　 本研究的不足及有待改进之处：
　　 1.由于脂质体的包封率(encapsulation efficiency,EE)会直接影响对比剂的质量,为此有必要考察包封率,并优化制备过程,在不影响粒径大小的前提下最大限度提高脂质体的包封率。
　　 2.“三步法”预定位组内肿瘤的强化主要在于抗原抗体的特异性反应及BAS的特异性放大作用；而在实际应用中,肿瘤抗原表达的多样性和不一致性势必对成像效果会有所影响。此外,多次注射的体内过程复杂,抗体和对比剂也会因多次注射而造成损耗。再者,在特定时间内多次注射毫克级单位的蛋白,在人体内应用可能会造成一定程度的免疫反应。
　　 3.尽管BAS具有放大作用,但与直接增强相比,“三步法”预定位技术的信号增强作用仍然是比较微弱的。要使肿瘤局部SPIO绝对数量进一步增加,提高强化效果；可以通过加大应用生物素化抗体和Av的量来实现。
　　 4.单克隆抗体预定位效果,即其与肿瘤血管内皮细胞靶点的结合率也是影响MR增强效果的重要因素,为此需要对其结合率进行定性定量评价,并探索提高结合率的途径。

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