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大鼠脑S100B和GFAP的表达变化在原发性脑干损伤诊断中的作用研究

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英文文摘

前言

参考文献

第一章 脑干损伤动物模型的建立及模型评价

一材料和方法

二结果

三讨论

参考文献

附图

第二章 实时荧光定量PCR法检测大鼠脑干组织中S100B-mRNA的表达变化

一材料和方法

二结果

三讨论

参考文献

附图

第三章 GFAP和S100B在原发性脑干损伤中的表达

一材料和方法

二结果

三讨论

参考文献

附图

全文小结

综述原发性脑干损伤的研究进展

参考文献

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摘要

原发性脑干损伤(Primary brain stem injury,PBSI)通常是指暴力作用于头部引起脑干为主的损伤,并于伤后立即发生持续时间较长的意识丧失乃至死亡。脑干损伤的类型包括脑干横断、挫裂、挫伤出血、弥散性轴索损伤(diffuse axonalinjury,DAI)和水肿等,脑干损伤的形态学改变与其机能障碍的不同步性是脑干损伤的最大特点和表现。往往在脑干的形态学改变并不明显时,机体已发生死亡。由于脑干损伤后死亡率较高、死亡者伤后存活时间短,伤后症状和其它类型颅脑损伤存在交叉,一般影像学检查以及死后常规病理学诊断常难以确定脑干是否存在损伤,使其在临床医学诊断以及法医学诊断中存在很大的困难。目前对于颅脑损伤后迅速死亡者的法医学鉴定仍然缺乏早期快速的诊断指标,因此,寻找确凿的脑干损伤早期病变的依据,成为确定是否脑干死的重要手段。
　　 大量研究表明,S100B对颅脑损伤有高度的敏感性及特异性。S100B属于钙结合蛋白,在哺乳动物中枢神经系统中,主要由神经胶质细胞合成和分泌,特别是星形胶质细胞和少突胶质细胞,具有脑特异性。当颅脑损伤时,由小胶质细胞分泌的IL-1强烈刺激星形细胞活化和增殖,产生大量的S100B。早在1965年McGecr等就证明,在体和离体实验中IL-1能显著上调S100B蛋白水平,使其升高较正常3倍以上。此外,IL-6,TNF-α对S100B蛋白的表达亦有促进作用。同时,S100B蛋白自身也可促进星形细胞的肥大、增殖,从而产生更多的S100B蛋白,形成正反馈调节。另外,S100B在脱髓鞘病、运动神经元病(多发性硬化、格林-巴利综合征)及Alzheimer病中亦出现高表达。但是,S100B蛋白在原发性脑干损伤中的基因及其蛋白表达情况,至今尚未见报道。
　　 胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillory acidic protein,GFAP),是星形胶质细胞的主要细胞骨架蛋白,也是特异性标志蛋白,正常情况下,对神经细胞起支持及代谢作用。脑干损伤后,星形胶质细胞即可发生增殖反应,出现明显的功能活跃,并于脑干损伤早期即有快速反应,是反应脑干损伤的灵敏指标之一。目前对其应用于颅脑损伤以及脑干损伤国外已有报道,认为其在诊断早期颅脑损伤诊断方面,是一个可靠的标记物。但国内对S100B蛋白在颅脑以及脑干损伤中的作用却鲜有报道,特别是在脑干损伤中的作用,无人提及。因此,本研究致力于①调查S100B蛋白在脑干损伤早期诊断中的作用；②同步研究GFAP在原发性脑干损伤中的作用、与S100B蛋白表达的关系、及其与损伤时间的关系,为脑干损伤时间的推断提供参考依据。
　　 综合现有文献,本研究在我们前期研究建立的脑干损伤动物模型的基础上,采用常规病理染色法观察脑干损伤形态学的改变,同时通过实时荧光定量PCR、免疫组织化学等技术,观察脑干损伤后S100B和GFAP的表达变化,以探索其在原发性脑干损伤诊断及时间推断中的意义。
　　 按照课题设计,本研究分为三部分。实验方法及实验结果如下:
　　 1.脑干损伤动物模型的建立和病理形态学观察
　　 自制动物模型装置,主要有铁支架、引导管、打击物及木板组成。实验动物为85只雄性SD大鼠,重量为180-220g,采用100g/L水合氯醛(300mg/Kg)腹腔注射麻醉大鼠,使大鼠俯卧于底座上；调整引导管对准枕骨粗隆,并观察呼吸和心率等生命体征的改变。让打击物从引导管的65cm处自由下滑打击大鼠,作用力的大小表示为65cm/450g/45°,每只大鼠只打击一次,其中5只大鼠即刻死亡未计入组内。生前损伤组70只,其中30min内死亡者10只,记为脑干损伤死亡组；60只存活分别于伤后2h、6h、12h、24h、48h、72h处死,记为伤后存活组,每组10只；正常对照组lO只不进行打击直接处死。所有处死大鼠均取脑干组织。
　　 结果:所有实验组大鼠均可见蛛网膜下腔出血明显,脑干组织水肿,脑干内见散在的点片状或椭圆形小片状出血,伤后30min内死亡者出血部位较为广泛,数量多,伤后存活者,出血数量相对较少。Gless银染发现对照组大鼠脑干组织轴索排列规整,走行一致,轴索间隙均一。30min内死亡的大鼠弥漫性分布的轴索肿胀、断裂、扭曲呈蚯蚓状,末端膨大,轴索间隙增宽。伤后2h、6h组在脑干见到上述轴索损伤变化更加明显,以轴索断裂、肿胀及扭曲为主。伤后12h可观察到因轴索断裂后轴浆流出到脑组织局部所形成的轴索收缩球,24h轴索收缩球数量增多,体积增大,至72h开始减少。
　　 2.实时荧光定量PCR法检测脑干组织中S100B-mRNA表达变化
　　 实验对象从上述各组中随机抽取,每组5只。严格按照试剂盒的操作步骤进行。
　　 结果:与对照组比较,30min内死亡组大鼠脑干组织中S100B-mRNA没有显著性差异；伤后2h组脑干组织中S100B-mRNA显著降低,之后随时间的延长,表达逐渐升高,并于24h达到高峰,48h基本降至正常水平,72h表达与正常对照组亦无显著差异。
　　 3.免疫组织化学方法检测脑干组织中S100B和GFAP的改变
　　 正常对照组可见S100B阳性染色均匀分布在星形胶质细胞胞体及突起中。30min死亡组和伤后存活组(2h、12h、24h、48h)可见大量阳性细胞表达,伤后存活组(72h)脑干组织的表达与正常对照组无统计学差异。正常对照组GFAP分布在星形胶质细胞的胞浆及突起中。伤后30min死亡组GFAP表达增强,有的细胞形态变得不规则；随时间的延长阳性表达逐步上升,至72h表达开始下降。
　　 根据以上研究结果,我们得出以下结论:
　　 1.采用上述方法制作的脑干损伤动物模型,是用外来机械作用力直接作用于颅骨,能准确的打击大鼠枕骨粗隆,可以较好的模拟人体真实状态下的颅脑损伤情况,且操作简单,易于评价,可用于脑干损伤的发生机制、病理生理改变及损伤后果等方面的研究。
　　 2.原发性脑干损伤后S100B-mRNA即有快速的表达,参与了神经细胞对损伤的应激反应,表达具有特异性,有时间规律,可以作为脑干损伤早期诊断的标记物。
　　 3.原发性脑干损伤后S100B、GFAP的表达能够反应损伤后星形胶质细胞的变化,在损伤后神经修复过程中具有重要作用,并且表达随损伤时间呈一定的变化规律,联合此两项指标综合分析,能对脑干损伤时间的推断提供参考。

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