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PEDF重组蛋白及PEDF基因靶向传输在抗肿瘤生长和血管增生中的作用及机制研究

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第一部分 PEDF重组蛋白通过抗血管增生抑制宫颈癌的生长

引言

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

第一部分结论

第二部分 纳米载体靶向传输PEDF基因治疗结直肠癌的研究

引言

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

第二部分结论

参考文献

附录

致谢

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摘要

本研究拟采用PEDF重组蛋白和PEDF基因靶向传输两种手段，探讨PEDF在抗肿瘤生长和血管增生中的作用及可能机制。研究围绕以下两方面进行：
　　 (1)观察PEDF重组蛋白对宫颈癌的治疗作用，并探讨其可能机制。
　　 (2)通过靶向肿瘤新生血管的纳米载体cRGD-PEG-PEI传输PEDF基因，观察在结直肠癌中的治疗效果，并初步探讨其可能机制。
　　 主要研究内容和结果如下：
　　 第一部分 PEDF重组蛋白通过抗血管增生抑制宫颈癌的生长
　　 1. PEDF在人宫颈癌组织中的表达降低免疫组织化学分析显示，PEDF蛋白在人正常宫颈的鳞状上皮组织和宫颈癌的癌旁非增生的鳞状上皮组织内均有较强的表达，然而，在宫颈鳞状上皮细胞癌癌巢内PEDF的阳性染色则很少，PEDF表达水平降低至正常宫颈鳞状上皮组织和癌旁非增生的鳞状上皮组织的6％左右(P＜0.01)。
　　 2.PEDF重组蛋白的表达和纯化将含PEDF-pET-30a(+)重组质粒的BL21(DE3)宿主菌，25℃用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，提取细菌裂解产物的可溶部分，Ni2+-His Bind Resin亲和柱纯化获得含有6×His-tag的PEDF重组蛋白。用凝胶成像系统对电泳条带进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达95％左右。用兔抗人PEDF抗体进行免疫印迹(Western blotting)分析得到分子量约为50 kDa的免疫杂交条带。
　　 3.PEDF在人宫颈癌裸鼠异位移植瘤模型中抑制肿瘤的生长与PBS对照组相比，PEDF处理组肿瘤生长较慢，在种瘤后第30天处死裸鼠，剥离肿瘤，称瘤重。结果显示：总剂量为15 mg/kg的PEDF蛋白对BALB/c裸鼠宫颈癌实体瘤的生长具有明显的抑制作用，抑瘤率为68％(P＜0.01)。
　　 4.PEDF在人宫颈癌裸鼠异位移植瘤模型中抑制肿瘤血管增生PEDF对肿瘤血管增生的作用通过对裸鼠肿瘤组织内免疫组织化学染色呈棕黄色的CD34(+)微血管的密度进行评价。结果显示PEDF处理组肿瘤组织中微血管密度明显低于PBS对照组(P＜0.01)。
　　 5.PEDF选择性抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖噻唑蓝(MTT)比色法分析PEDF对HUVECs和宫颈癌细胞HeLa的增殖作用。结果显示，PEDF在10 mol/L即可抑制HUVECs的增殖，并随浓度增高呈明显的剂量依赖关系(P＜0.01)，IC50为200 nmol/L。而用PEDF处理常氧或低氧条件下培养的HeLa细胞，发现即使在640 nmol/L的高剂量组同对照组相比细胞存活率也没有明显差别。
　　 6.PEDF特异性诱导HUVECs凋亡用膜联蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(PI)双染标记细胞，利用流式细胞仪分析PEDF对HUVECs和HeLa的凋亡作用。结果显示，200nmol/L的PEDF处理24 h的HUVECs细胞凋亡率为17.2±2.7％，明显高于PBS对照组6.5±0.5％(P＜0.01)。而常氧和低氧条件下，320 nmol/L的PEDF处理48 h的HeLa细胞调亡率与PBS对照组相比均无明显差异。
　　 7.PEDF下调HeLa细胞中VEGF的表达免疫细胞化学和Westernblotting分析HeLa细胞中VEGF的表达。结果显示，低氧诱导HeLa细胞中VEGF的表达增高，80 nmol/L以上浓度的PEDF能够剂量依赖性地抑制低氧下HeLa细胞中VEGF的表达(P＜0.01)。
　　 8.PEDF抑制HeLa细胞中HIF-1α的表达及核转位免疫细胞化学和Western blotting分析HeLa细胞中HIF-1α的表达。结果显示：常氧下培养的HeLa细胞HIF-1α表达很低，且主要位于胞浆；低氧处理的HeLa细胞HIF-1α表达明显增高，以细胞核尤为明显；用320 nmol/L的PEDF处理后，可见HeLa细胞中HIF-1α的表达明显降低，且主要位于胞浆(P＜0.01)。表明PEDF可以抑制低氧诱导的HeLa细胞中HIF-1α的表达及核转位。
　　 第二部分纳米载体靶向传输PEDF基因治疗结直肠癌的研究
　　 1.纳米载体PEG-PEI和cRGD-PEG-PEI的合成本研究以聚乙烯亚胺(PEI)为纳米载体骨架，用聚乙二醇(PEG)修饰以避免自身聚集降低毒性，并结合特异靶向于整合素αvβ3的cRGD肽，构建了靶向肿瘤新生血管的纳米载体cRGD-PEG-PEI，经核磁共振氢谱(1H NMR)分析证实成功合成目标产物。
　　 2.真核表达质粒PEDF-pcDNA3.1(+)和PEDF-EGFP-pcDNA3.1(+)的构建本研究中构建了PEDF-pcDNA3.1(+)以表达内源性PEDF蛋白，同时还构建了EGFP-pcDNA3.1(+)和PEDF-EGFP-pcDNA3.1(+)以表达绿色荧光蛋白(GFP)以及PEDF-GFP融合蛋白，便于观察基因转染效果，经PCR、双酶切鉴定和测序比对证实目的基因已成功插入到载体的多克隆位点，没有出现移码突变。
　　 3.纳米载体能够有效缩合质粒DNA至纳米级粒径粒径测定和凝胶电泳阻滞实验结果显示：随着N/P比值逐渐增高，阳离子聚合物纳米载体通过静电作用逐渐有效缩合带负电的质粒DNA。cRGD-PEG-PEI与PEG-PEI的相比，缩合质粒DNA的能力有所下降，两者分别在N/P≥4和N/P≥2时不再出现质粒电泳条带，在N/P≥10和N/P≥7时得到的复合物粒径在100nm以内，可能原因是靶向分子cRGD的立体构象造成的空间位阻影响到纳米载体缩合质粒DNA的过程。
　　 4.纳米载体在一定条件下具有最佳的基因转染效果纳米载体的基因传输效率首先在易于转染的HEK-293细胞进行评价。MTT毒性实验结果显示，在N/P≥30后纳米复合物与未转染对照组相比产生明显细胞毒性，细胞存活率在N/P=30时约90％，在N/P=60时约60％。纳米载体的基因转染效率在N/P=4、7、10时依次增高，N/P≥10后增加不明显。PEG-PEI和cRGD-PEG-PEI在相同N/P比值的细胞毒性、转染效率均无明显差异。
　　 5.cRGD-PEG-PEI在HUVECs细胞的基因靶向传输流式细胞计数结果显示：在相同N/P比时，cRGD-PEG-PEI和PEG-PEI对HEK-293的转染效率无明显差异；对HUVECs细胞的转染效率eRGD-PEG-PEI(53.7±3.3％)是PEG-PEI(19.5±1.2％)的两倍以上(P＜0.01)。cRGD-PEG-PEI转染同时加入过量游离cRGD后，转染效率明显降低(P＜0.01)，且与相同N/P时PEG-PEI的转染效率相比无明显差异。表明cRGD-PEG-PEI与PEG-PEI相比转染效率的增高是由靶向分子cRGD所介导。
　　 6.两种PEDF的真核表达质粒均可以表达PEDF蛋白，但PEDF-GFP融合蛋白在细胞内表达后不能分泌至细胞外Western blotting结果显示，两种PEDF的真核表达质粒转染HEK-293和HUVECs细胞后均能检测到细胞总蛋白中PEDF蛋白的表达。而且荧光显微镜下可观察到PEDF-GFP融合蛋白在细胞胞浆的表达。然而，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果发现仅PEDF-pcDNA3.1(+)转染细胞后的培养液上清中有PEDF蛋白的分泌，PEDF-EGFP-pcDNA3.1(+)转染细胞后表达的PEDF-GFP融合蛋白未分泌至培养液上清中，可能C端融合表达GFP蛋白影响了PEDF的分泌。
　　 7.cRGD-PEG-PEI靶向传输PEDF基因在人结直肠癌裸鼠异位移植瘤模型中抑制肿瘤的生长与生理盐水组及空质粒对照组相比，PEDF组肿瘤生长较慢。在种瘤后第30天处死裸鼠，剥离肿瘤，称瘤重。结果显示：经瘤周注射总剂量为3.75 mg/kg的PEDF-pcDNA3.1(+)与N/P=15的cRGD-PEG-PEI的复合物进行治疗后，对结直肠癌原发瘤的生长具有明显的抑制作用，平均抑制率为67.4％(P＜0.01)。
　　 8.cRGD-PEG-PEI靶向传输PEDF基因在人结直肠癌裸鼠异位移植瘤模型中抑制肿瘤血管增生PEDF对肿瘤血管增生的作用通过对裸鼠肿瘤组织内免疫组织化学染色呈棕黄色的CD34(+)微血管的密度进行评价。结果显示PEDF处理组肿瘤组织中微血管密度明显低于生理盐水组及空质粒对照组(P＜0.01)。
　　 9.PEDF重组蛋白对人结直肠癌细胞SW620的增殖没有直接抑制作用用PEDF重组蛋白处理SW620细胞，发现包括640 nmol/L的高剂量组在内的各PEDF处理组同对照组相比细胞存活率均没有明显差别。提示PEDF对人结直肠癌细胞SW620的生长并无直接抑制作用。
　　 结论及研究意义：
　　 1.PEDF重组蛋白通过抗血管增生抑制宫颈癌的生长。
　　 2.PEDF通过抑制HIF-1α来下调肿瘤细胞中VEGF的表达，削弱VEGF对肿瘤组织中新生血管内皮细胞的旁分泌效应，可能是PEDF抗肿瘤活性的一个新机制。
　　 3.PEDF基因靶向传输通过抗血管增生抑制结直肠癌的生长。
　　 4.通过靶向整合素αvβ3的cRGD配体修饰的纳米载体实现针对肿瘤新生血管的基因靶向传输，为血管增生抑制因子的抗肿瘤治疗研究提供了新的视野。

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