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野生型和P370L突变型Myocilin原核表达载体的构建及蛋白表达的初步研究

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前言

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

全文结论

问题与展望

参考文献

致谢

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摘要

青光眼已成为世界第二位的致盲眼病。1997年Stone等在《Science》上首先发表文章，报道Myocilin基因为家族性开角型青光眼的致病基因。从此，关于Myocilin基因及蛋白的结构、功能及青光眼的致病作用的研究成为热点。然而，时至今日，突变型．Myocilin基因及蛋白在家族性开角型青光眼发病中的致病作用仍存有争论。 本课题组在国内率先对一个家族性开角型青光眼的家系进行了长达20年的追踪调查，经过系列全面、系统的临床及实验室研究，确定Myocilin基因P370L突变是该家系家族性开角型青光眼的致病基因，并将其命名为广州1号(GZ.1)；最近课题组又在广东普宁发现了一个新的家族性开角型青光眼家系，命名为普宁1号(PN．1)，最终测序结果再次将致病基因锁定在了MYOC基因Pro370Leu突变，于GZ.1号致病基因的定位完全相同，再次证明了该突变在中国南方家族性开角型青光眼的研究中的普遍性和重要性；课题组后续的实验室研究显示，通过将P370L突变型Myocilin基因真核表达载体瞬时转染人小梁细胞，发现P370L突变型Myocilin蛋白细胞外分泌障碍，在胞浆内形成积聚体，推测其致病机理为P370L突变型Myocilin蛋白错误折叠、空间构象发生改变，进而获得病理性功能影响小梁细胞内质网应激反应以及线粒体的功能，引发小梁细胞级联病理反应，影响房水的外流，从而导致青光眼的发生。本研究为了进一步研究野生型和P370L突变型Myocilin蛋白的功能及结构特性，通过构建野生型和P370L突变Myocilin基因原核表达载体，并进行了蛋白表达的初步研究，旨在利用原核表达系统，获得高纯度的野生型和P370L突变型Myocilin蛋白，为后续的工作奠定基础。 目的 运用分子克隆技术，构建野生型和P370L突变型Myocilin原核表达载体，进行野生型和P370L突变型Myocilin蛋白的体外表达，利用亲和层析技术进行蛋白纯化，得到野生型和P370L突变型Myocilin蛋白，为下一步的工作奠定基础。 方法 1.应用PCR的方法，以课题组已经成功构建的另一真核载体为模板，扩增野生型和P370L突变型Myocilin cDNA； 2.应用T4DNA连接酶连接双酶切后的目的基因和载体。 3.应用酶切、PCR、测序的方法鉴定重组质粒。 4.应用原核表达的方法在大肠杆菌中表达野生型和P370L突变型Myocilin蛋白。 5.应用亲和层析的方法进行野生型和P370L突变型Myocilin-GST融合蛋白的纯化。 6.应用SDS-PAGE的方法检测蛋白的表达。 结果 1.目标基因可高效扩增，所构建载体pGEX-4t-1/E-w和pGEX-4t-1/E-370经酶切、PCR、测序鉴定，开放阅读框无移码突变，野生型Myocilin目的基因序列无任何突变；P370L突变型Myoeilin序列除370突变外，无任何突变。 2.野生型和P370L突变型Myocilin在原核系统中表达后与阴性对照相比，可出现明显的蛋白条带，但是表达量较少；通过亲和层析的方法初步纯化野生型和P370L突变型Myocilin-GST融合蛋白后，可在目标分子量处看到目标条带，但条带较弱，并伴有GST蛋白。 结论 1.野生型和P370L突变型Myocilin原核表达载体构建成功，分别命名为pGEX-4t-1/E-W和pGEX-4t-1/E-370。 2.野生型和P370L突变型Myocilin在原核系统中可被诱导表达，并且通过亲和层析的方法初步纯化了野生型和P370L突变型Myocilin-GST融合蛋白。

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