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组织工程技术修复兔颞下颌关节盘穿孔的实验研究

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引言

第1部分兔骨髓间充质干细胞和关节盘细胞分离培养的实验研究

第2部分聚乳酸支架材料的改性及其细胞相容性的实验研究

第3部分组织工程技术修复兔关节盘穿孔的实验研究

结束语与展望

附图

主要英文缩略词表

在读期间发表论文

综述1骨髓间充质干细胞在软骨组织工程的应用

综述2关节盘的组织结构及其生物学特性的研究进展

致谢

原创性申明

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摘要

关节盘是颞下颌关节的重要组成部分之一，具有极其重要的生理功能。因关节盘前移、骨关节病和外伤等原因导致的关节盘穿孔、破碎甚至缺失在临床上十分常见。由于关节盘组织的再生能力极其有限，关节盘穿孔或破碎后难以自身修复。若不得到适当的治疗，穿孔的关节盘不但不能被修复，而且穿孔可能因磨损、关节软骨退行性改变而加重，常常发展成为髁状突骨质破坏、骨赘形成，最终导致关节疼痛、张口受限乃至整个关节功能的丧失。迄今为止，尚无一种理想的方法治疗关节盘穿孔或破碎：传统的关节盘摘除术、关节盘成形术、关节盘修补术及高位髁状突切除术等虽然有一定的治疗效果，但存在很多不足；自体组织移植可造成附加损伤，且组织来源有限，形状不匹配；异体组织的免疫排斥反应等问题尚未得到很好的解决；人工替代品的异物反应、感染、松动等问题限制了其临床应用。因此，探索一种新的修复关节盘穿孔破碎的方法仍然是口腔颌面外科医生面临的重要任务之一。 随着各相关学科的发展，一门集多学科于一体的交叉学科——组织工程学开始兴起。其基本思想是从机体获取种子细胞，将体外培养扩增后的高浓度有活力的种子细胞接种到一种生物相容性好、可生物降解及具有多孔结构的支架材料中，然后将此细胞—材料复合物植入体内缺损的部位，在支架材料逐步降解吸收过程中，种子细胞增殖分化，形成新的具有一定功能和形态的组织，达到修复缺损重建功能的目的。 因此，组织工程技术有望成为治疗关节盘穿孔或破碎的新方法，本研究试图探讨了用组织工程技术修复兔关节盘穿孔的可行性。由于组织工程技术需要大量的种子细胞和良好的细胞支架材料，本研究从种子细胞开始进行研究，观察聚乳酸(Poly-lacticAcid，PLA)的生物相容性，体外构建了细胞—PLA支架复合物，并观察其在体内对关节盘穿孔的修复作用。本实验的研究内容如下： 第1部分.兔骨髓间充质干细胞和关节盘细胞的分离培养的实验研究 实验1兔骨髓间充质干细胞的分离培养及其定向诱导分化的实验研究 目的：探索分离培养兔骨髓间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSC)的方法，研究在特定培养液作用下MSC向软骨细胞表形转化，探讨其作为组织工程化软骨的种子细胞的可行性。 材料与方法：自兔胫骨上端处抽取4-6mL骨髓后用梯度离心法分离骨髓单个核细胞，进行原代和传代培养，测定不同代次MSC生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期，透射电镜下观察MSC超微结构。对第3代MSC以TGF-β进行软骨诱导分化对诱导后的细胞行甲苯胺蓝、免疫组化染色，透射电镜观察诱导后细胞的超微结构。 结果：原代培养的MSC24h后开始贴壁，大部分呈圆形、椭圆形，72h可见集落形成，4-5d可见集落形成，10-14d融合80-90％以上，细胞形态大部分为梭状成纤维细胞样，少部分成椭圆形。流式细胞仪检测显示MSC84.8％的细胞处于G0+G期，电镜观察显示MSC表现出核浆比例大等早期幼稚细胞形态的特点。在加入特定诱导液后，细胞增殖速度明显降低，细胞形态呈梭形、多角形、多边形，周围可见折光性较强的细胞外基质，甲苯胺蓝显示胞浆异染颗粒、Ⅱ型胶原染色阳性，电镜观察到细胞核浆比例小，胞浆内细胞器丰富，高尔基体发达。 结论：兔自体骨髓间充质干细胞有种子细胞的生物学和形态学基础，增殖较快，在特定培养液诱导下能向软骨细胞表形转化，有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞。 实验2兔颞下颌关节盘纤维软骨细胞分离培养的实验研究 目的：探讨颞下颌关节盘纤维软骨细胞的分离及体外扩增的条件，观察关节盘纤维软骨细胞体外培养的生物学特性。 材料和方法：在无菌条件下，切取2周龄新西兰白兔颞下颌关节盘，剪成1.0mm3的碎块，0.5g/mL胰酶消化30min、胶原酶消化4h，200目筛网过滤，获得关节盘纤维软骨细胞。在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，对第2、3、4、5、10代细胞绘制生长曲线，流式细胞仪测定第5、10细胞周期，甲苯胺蓝染色，Ⅰ、Ⅱ胶原免疫组化染色，测定其生长曲线。透射电镜观察细胞超微结构。 结果：原代培养的关节盘纤维软骨细胞12h可观察到贴壁细胞，48h贴壁细胞逐渐增多，大部分细胞为短梭形，小部分为多角形，4d可见多个细胞克隆形成，第8d时细胞彼此相连，铺满瓶底，细胞以梭形为主，部分为多角形。传代后12h贴壁率达90％，大部分为多角形，4-5d即可长满瓶底。甲苯胺蓝染色可见异染颗粒，I、Ⅱ胶原免疫组化染色胞浆内可见棕黄色颗粒。细胞内线粒体、内质网发达、高尔基体发达。 结论：体外分离培养的兔颞下颌关节盘纤维软骨细胞具有较强的增殖能力，可作为组织工程修复关节盘穿孔理想的种子细胞。 第2部分.聚乳酸支架材料的改性及其细胞相容性的实验研究 目的：探索改善聚乳酸(PLA)亲水性和细胞相容性的方法，评价改性后的PLA作为软骨组织工程技术中细胞培养支架的可行性。 材料与方法：对PLA先后进行碱溶液水解、无水酒精湿化处理、多聚赖氨酸包埋等一系列处理，对处理前后PLA记录水滴渗入时间、测量吸水量，将关节盘纤维软骨细胞接种PLA中，光镜下观察细胞在支架材料中的生长情况，第6天测定细胞吸附率，并进行扫描电镜观察。 结果：改性前后的PLA水滴渗入时间分别为43.8±2.1(min)和2.1±0.5(min)，吸附水量分别为自身体重的186.5±33.5(％)、610.2±20.3(％)，细胞吸附率分别为14.75％和31.15％。培养21d后，有细胞碎片从复合物中游离出来，4w时PLA表面活细胞减少，支架外形基本不发生变化，12w时支架中未能观察到细胞，支架出现碎裂似豆腐渣，无法维持稳定的外形，力学性能差，培养液可将其吹散，说明PLA逐步降解。 结论： (1)本实验采用的聚乳酸多孔三维支架，空隙率在90％，孔径100-300μm，具有良好的空隙率； (2)PLA经改性后亲水性显著改善，细胞吸附率明显提高，有利于细胞粘附； (3)利用PLA体外构建组织工程化软骨组织在普通培养条件下的仍然有一定的难度，有必要采用生物反应器。 第3部分.组织工程技术修复兔关节盘穿孔的实验研究 目的：探索以自体MSC或异体关节盘纤维软骨细胞为种子细胞、以PLA为载体材料的组织工程技术修复兔关节盘穿孔的可行性。 材料与方法：成年健康新西兰白兔36只，3-4月龄，体重2.0-2.5kg，分笼饲养。随机分为正常对照组(N组)6只和实验组30只，实验组分为5小组，每小组6只。以质量分数为50mg/mL的氯胺酮按1mL/kg对实验动物进行肌注麻醉，并以地西泮1mL/kg辅助麻醉。无菌条件下先后暴露左右侧关节盘，并以特制的穿刺针分别造成一直径2.6mm的穿孔。A组：空白对照组，不作任何材料植入；B组：在穿孔处植入自体MSC-纤维蛋白凝胶(FibrinGlue，FG)复合物；C组：在穿孔处植入同种异体关节盘细胞-FG；D组：在穿孔处植入同等大小的自体MSC-PLA复合物并以FG辅助固定；E组：在穿孔处植入同等大小的同种异体关节盘细胞-PLA复合物并以FG辅助固定。分别于术后第12、24、36周取材，观察穿孔处大体和组织学情况，髁状突行扫描电镜观察，评估修复效果。 结果：A、B、C组术后12、24、36周关节盘穿孔处空虚，无一例愈合，髁状突不同程度的软骨增生与剥脱，扫描电镜下可见凝胶状物质不完整，部分区域胶原暴露，说明骨关节病形成。D、E组术后12、24、36周时穿孔处可见新生组织，再生组织在大体、组织学方面，总体上接近正常组织。髁状突呈“水滴”样，表面光滑，未见软骨增生或剥脱，扫描电镜显示凝胶状物质完整，未见髁状突胶原纤维暴露。 结论： (1)本实验证实，新西兰大白兔2.6mm关节盘穿孔不能自然愈合，36周后最终髁状突软骨剥脱，胶原纤维暴露，骨关节病形成。 (2)在本实验条件下，自体MSC或同种异体关节盘细胞复合FG不能使新西兰大白兔2.6mm关节盘穿孔愈合，36周时，骨关节病形成。

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