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PCR在啤酒厂快速鉴定啤酒有害菌的应用研究

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第一章绪论

一.什么是啤酒有害菌

二.啤酒有害菌的传统检测方法

三.啤酒有害菌快速鉴定的研究现状

四.啤酒厂开展啤酒有害菌快速鉴定研究的意义和内容

第二章啤酒厂啤酒有害菌的种类

1.材料

1.1样品

1.2培养基

1.3试剂与耗材

1.4酶和引物

1.5溶液

1.6仪器

2.方法

2.1膜过滤分离培养

2.2啤酒危害试验

2.3细菌DNA提取

2.4 16S rDNA序列扩增

2.5 16S rDNA序列分析

2.6生理生化鉴定

2.7 G+C%含量测定

2.8产乳酸鉴定

3.结果与分析

3.1啤酒有害菌的分离

3.2啤酒有害菌的基本特性

3.3啤酒有害菌的鉴定

3.4啤酒非有害菌的鉴定

4.本章小结

第三章基于16s rDNA的PCR快速鉴定啤酒有害菌的研究

1.材料与方法

2.结果与分析

2.1啤酒有害菌的亲缘关系

2.2有害菌16s rDNA同源序列及引物设计

3.本章小结

第四章基于抗酒花基因horA的PCR快速鉴定啤酒有害菌的研究

1.材料

1.1有害菌株

1.2培养基

1.3试剂与耗材

1.4根据horA基因设计的引物

1.5溶液

1.6仪器

2.方法

2.1膜过滤分离培养

2.2细菌质粒DNA提取

2.3 horA基因部分序列扩增

2.4 PCR产物电泳检测

2.5 horA部分序列分析

3.结果与分析

3.1 horA基因的检验

3.2 PCR检验的灵敏度研究

3.3培养温度对有害菌生长的影响

3.4不同培养基对有害菌生长的影响

3.5培养基的进一步优化

3.6生产线成品纯生啤酒有害菌的PCR检验验证

3.7 PCR快速检测啤酒有害菌流程

4.本章小结

第五章样品的PCR前处理

1.材料

1.1培养基及试剂

1.2仪器设备

2.方法

3.结果与分析

3.1可过滤样品的预处理

3.2不可过滤样品的预处理

4.本章小结

第六章结论与展望

一.结论

二.创新点

三.展望

参考文献

附表

附件

致谢

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摘要

本文的研究工作主要内容分4个部分: 首先对啤酒厂啤酒酿造过程及环境中有害菌的分布及种类进行了研究。在啤酒厂,从麦汁、发酵液、清酒、储存酵母、设备表面、成品啤酒中共分离到112株可在厌氧环境条件在NBB培养基中生长的细菌。经过对这112株细菌对啤酒的腐败试验,确定其中44株为啤酒有害菌。通过对这44株有害菌进行梅里埃生理生化鉴定、16srDNA序列分析、产乳酸试验等,得知这44株有害菌分属于以下2个属的8种乳酸菌: Leuconostocpseudomesenteroides、Leuconostoccitreum、Lactobacilluscollinordes、Lactobacillusbrevis、Lactobacillusfructivorans、Lactobacillusparacasei、Lactobacillusplantarum、Lactobacillusacetotolerans。 其次,以细菌16srDNA为基础,对有害菌快速鉴定进行了研究。根据文献记载以及本研究所确定的有害菌种类,从Genebank中下载有害菌所在属的63种细菌的16srDNA序列,用DNAstar软件进行序列对比分析,找出这63种细菌16srDNA序列所共有的5条同源序列,以这5条同源序列为基础设计出一对适合所有有害菌的通用引物:上游:5’-GAACAGGATTAGATACCC-3’,下游:5’-GACTTAACCCAACATCTCAC-3’。利用该对引物,可以检测出啤酒厂出现的8种有害菌,而对啤酒中常出现的13种非有害菌则不能检出,保证了该引物对啤酒有害菌的特异性。 以抗酒花基因horA为基础对有害菌快速鉴定进行了研究。由于啤酒有害菌大多为乳酸菌,根据文献研究所得出的结论:啤酒乳酸菌大多含有抗酒花基因horA,利用以horA基因为基础设计的引物LbHC-1:5’-ATCCGGCGGTGGCAAATCA-3'和LbHC-2:5'-AATCGCCAATCGTTGGCG-3’对有害菌进行快速鉴定。PCR反应条件为:在25μLPCR反应体系中,加入浓度为10μM的引物LbHC-1和LbHC-2各1μL,10×PCR反应缓冲液(含Mg2+)3μL,混合ddNTP0.8μL,TaqE(5U/μL)0.4μL,DNA5μL,双蒸水13.8uL。循环体系:首轮循环94℃变性3min,接着以94℃1min,55℃2min,72℃30sec进行25个循环。PCR产物用1%低琼脂糖凝胶电泳检测。凝胶PCR所需时间总共为4小时。由于PCR检测有害菌存在细胞检测灵敏度问题,因此在检测之前必须对啤酒样品进行富集增菌培养,使细胞数达到可以检测出的水平。富集培养是啤酒有害菌快速检出的门槛及瓶颈,富集培养所需的时间越短,检测所需总时间就越短,检测效率就越高。本研究比较了4种培养基的增菌效果,其中MRS增菌速度最快。对有害菌培养的最适温度是30℃。在MRS培养基中添加生长因子D-泛酸、菸酸胺、烟酸、叶酸、VB12、生物素、VB6、VB1、核黄素,观察对啤酒有害菌增殖的效果。结果显示:添加100mg/L叶酸的MRS培养基比不加叶酸的MRS培养基对8种有害菌株的生长有明显的促进作用。实验还表明:PCR检测有害菌细胞的灵敏度为3~70个细胞(CFU),而用MRS培养基加100mg/L叶酸对样品进行富集,可以使一个有害菌细胞在培养16小时后超过70个。另外,细菌质粒DNA提取方法对检测时间及灵敏度的影响也进行了研究。在抽提法、煮沸法、冻融法、菌体直接PCR等4种提取方法中,除菌体直接PCR不能检出有害菌外,抽提法、煮沸法、冻融法都可检测出有害菌,且3种方法检测的灵敏度一致,但煮沸法较抽提法和冻融法更省时,更经济,更环保。用添加了100mg/L叶酸的MRS培养基增殖细胞,用煮沸法提取质粒DNA,经凝胶PCR检测,所需时间总共不超过24小时。将凝胶PCR方法应用于生产线上的纯生啤酒有害菌检测,结果表明:与用传统的平板培养计数方法检测相比,结果的一致率达到99.7%。凝胶PCR方法比传统的平板培养计数方法有更高灵敏度。 最后对可过滤样品和不可过滤样品的预处理进行了研究。对于可过滤样品,将过滤后的膜用超声波振荡处1分钟,以使粘附于膜面上的菌体脱落于水中,便于离心收集菌体;对于不可过滤样品,用低速离心将酵母除去,上清液用高速离心收集有害菌体,用于PCR检测。

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