猪瘟病毒NS5B蛋白与猪免疫应答因子TRIF、MyD88和MAVS的多克隆抗体制备及其相互作用初探

声明

摘要

英文缩写对照表

第一章 前言

1．1 猪瘟和猪瘟病毒

1．1．1 猪瘟病毒非编码区功能特点

1．1．2 猪瘟病毒结构蛋白功能特点

1．1．3 猪瘟病毒非结构蛋白功能特点

1．2 NS5B研究进展

1．3 猪瘟病毒与固有免疫应答

1．3．1 TLR信号通路

1．3．2 RLR信号通路

1．4 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验所用毒株、细胞、载体、细菌株、抗体

2．1．2 实验仪器与设备

2．1．3 实验试剂及配制

2．2 实验方法

2．2．1 技术路线

2．2．2 引物设计

2．2．3 基因的克隆

2．2．4 基因的亚克隆

2．2．5 重组蛋白的表达、纯化

2．2．6 多克隆抗体的制备

2．2．7 多克隆抗体反应性的鉴定

2．2．8 Western Blot鉴定多克隆抗体与宿主细胞蛋白的特异性

2．2．9 CSFV与免疫应答因子相互作用的初步探索

第三章 实验结果

3．1 抗CSFV NS5B多克隆抗体的制备

3．1．1 CSFV NS5B基因片段的克隆

3．1．2 原核表达载体pET-NS5B(222)的构建

3．1．3 NS5B重组菌的诱导及其表达形式的鉴定

3．1．4 原核表达NS5B蛋白的纯化与鉴定

3．1．5 抗CSFV NS5B多克隆抗体与原核表达NS5B蛋白的反应性

3．1．6 抗CSFV NS5B多克隆抗体与真核细胞瞬时表达NS5B蛋白的反应性

3．1．7 抗CSFV NS5B多克隆抗体与感染CSFV的PK-15细胞表达NS5B蛋白的特异性

3．2 抗猪TRIF多克隆抗体的制备

3．2．1 原核表达载体pET-TRIF(217)的构建

3．2．2 TRIF重组菌的诱导及其表达形式的鉴定

3．2．3 原核表达TRIF蛋白的纯化与鉴定

3．2．4 抗猪TRIF多克隆抗体与原核表达TRIF蛋白的反应性

3．2．5 抗猪TRIF多克隆抗体与真核PK-15细胞表达TRIF蛋白的特异性

3．3 抗猪MyD88多克隆抗体的制备

3．3．1 原核表达载体pET-MyD88(202)的构建

3．3．2 MyD88重组菌的诱导及其表达形式的鉴定

3．3．3 原核表达MyD88蛋白的纯化与鉴定

3．3．4 抗猪MyD88多克隆抗体与原核表达MyD88蛋白的反应性

3．3．5 抗猪MyD88多克隆抗体与真核PK-15细胞表达MyD88蛋白的特异性

3．4 抗猪MAVS多克隆抗体的制备

3．4．1 原核表达载体pET-MAVS(220)的构建

3．4．2 MAVS重组菌的诱导及其表达形式的鉴定

3．4．3 原核表达MAVS蛋白的纯化与鉴定

3．4．4 抗猪MAVS多克隆抗体与原核表达MAVS蛋白的反应性

3．4．5 抗猪MAVS多克隆抗体与真核PK-15细胞表达MAVS蛋白的特异性

3．5 猪瘟病毒与免疫应答因子相互作用的初步探索

3．5．1 qPCR检测CSFV感染对诱导细胞免疫应答因子mRNA水平的影响

3．5．2 Western Blot检测CSFV感染对细胞免疫应答因子蛋白水平的影响

第四章 讨论

4．1 多克隆抗体的制备

4．2 多克隆抗体的检测

4．3 猪瘟病毒与免疫应答因子的相互作用

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况