声明
摘要
第一章 前言
1．1 核开关(Riboswitch)研究进展
1．1．1 核开关的发现及命名
1．1．2 核开关的类型
1．1．3 核开关的调控机理
1．1．4 研究核开关的方法
1．1．5 SAM核开关的研究进展
1．2 十字花科黑腐病菌分子生物学研究简介
1．2．1 十字花科黑腐病菌简介
1．2．2 十字花科黑腐病菌致病机理研究进展简介
1．2．3 十字花科黑腐病菌的基因表达调控进展简介
1．3 本研究的目的和意义
第二章 材料与方法
2．1 菌株和质粒
2．2 探针及引物
2．3 抗生素
2．4 培养基
2．5 试剂和缓冲液
2．6 菌株的活化、培养及保存条件
2．7 相关试材
2．8 总DNA的提取
2．9 质粒DNA的提取
2．10 电泳
2．10．1 DNA的琼脂糖凝胶电泳
2．10．2 RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳
2．11 常规PCR反应
2．12 DNA纯化
2．13 DNA酶切
2．14 DNA胶回收
2．15 DNA连接
2．16 感受态细胞的制备
2．17 转化
2．17．1 化学转化
2．17．2 电脉冲转化
2．18 测序
2．19 三亲本结合
2．20 突变体营养缺陷型检测
2．21 植株致病力测定
2．22 GUS活性测定
2．22．1 平板检测
2．22．2 定量检测
2．23 翻译融合报告菌株的构建
2．24 引物介导的定点突变
2．25 RSA操作
2．25．1 RNA的提取
2．25．2 RHA的定量与纯度测定
2．26 RT-PCR
2．26．1 RNA样品中的DNA消化处理
2．26．2 RNA消化产物的验证
2．26．3 反转录合成cDNA
2．26．4 以cDNA为模板进行PCR验证
2．27 Northern Blot
2．28 生物信息学分析方法
2．29 5’-RACE
2．29．1 RNA的提取及纯度检测
2．29．2 DNA的消化及验证
2．29．3 第一链cDNA合成
2．29．4 S.N.A.P. 柱纯化cDNA
2．29．5 cDNA加尾
2．29．6 dC-tailed常规PCR
第三章 结果与分析
3．1 Xcc 8004基因组中存在一段与I型SAM核开关序列高度相似的序列
3．2 SAM-IXcc位于一个可能是编码甲硫氨酸合成途径关键酶的基因簇的5’ UTR区
3．3 XC1251-XC1252-XC1253共转录
3．4 XC1251-XC1253基因簇是Xcc 8004合成甲硫氨酸必需的且与致病相关
3．4．1 XC1251-XC1253基因簇突变体为甲硫氨酸营养缺陷型
3．4．2 极性突变体1201pk2在含有甲硫氨酸的基本培养基中恢复生长
3．4．3 甲硫氨酸营养缺陷型突变体的致病力下降
3．5 XC1251-XC1253基因簇的转录受甲硫氨酸的抑制
3．6 5’ UTR1251-1253具有感受甲硫氨酸和调控XC1251-XC1253基因簇表达的功能
3．6．1 XC1251-XC1253基因簇的转录起始位点的确定
3．6．2 报告菌株8004／pLAFR3-UTR1251-GUS的构建
3．6．3 甲硫氨酸对8004／pLAFR3-UTR1251-GUS的GUS活性影响
3．7 SAM-IXcc能够感受甲硫氨酸并调控XC1251-XC1253基因簇的表达
3．7．1 SAM-IXcc的二级结构及腺苷甲硫氨酸结合位点预测
3．7．2 SAM-IXcc中推测的腺苷甲硫氨酸结合位点的突变导致感受甲硫氨酸的能力下降
3．8 转录提前终止可能是SAM-IXcc调控XC1251-XC1253基因簇的机制
3．8．1 总RNA提取、消化及cDNA的合成
3．8．2 适体存在时导致基因转录提前终止
第四章 结论与讨论
4．1 结论
4．2 讨论
4．2．1 Northern Blot结果显示XC1251的5’ UTR区转录的复杂性
4．2．2 8004／pLAFR6-MtUTR1251-2证实SKM-IXcc二级结构预测与其自然构象存在偏差
4．2．3 SAM与SAM-IXcc体外结合条件的探索及In-line Probing检测条件优化
4．2．4 体外转录检测转录提前终止
参考文献
附录1
致谢
攻读学位期间发表论文情况
